Protein Science

Hệ số hấp thụ mol, ε, của một protein thường được dựa trên nồng độ được đo bằng khối lượng khô, phân tích nitơ hoặc amino acid. Các nghiên cứu được báo cáo ở đây cho thấy phương pháp Edelhoch là phương pháp tốt nhất để đo ε cho một protein. (Phương pháp này được mô tả bởi Gill và von Hippel [1989, Anal Biochem 182:319–326] và dựa trên dữ liệu từ Edelhoch [1967, Biochemistry 6:1948–1954].) Độ hấp thụ của một protein tại 280 nm phụ thuộc vào nội dung của Trp, Tyr và cystine (liên kết disulfide). Các giá trị ε trung bình cho các chromophore này trong một mẫu 18 protein được đặc trưng tốt đã được ước tính, và các giá trị ε trong nước, propanol, 6 M guanidine hydrochloride (GdnHCl) và 8 M ure đã được đo. Đối với Trp, các giá trị ε trung bình cho các protein thấp hơn các giá trị ε được đo trong bất kỳ dung môi nào. Đối với Tyr, các giá trị ε trung bình cho các protein nằm giữa các giá trị đo trong 6 M GdnHCl và các giá trị đo trong propanol. Dựa trên một mẫu 116 giá trị ε đã đo cho 80 protein, ε tại 280 nm của một protein gập trong nước, ε(280), có thể được dự đoán tốt nhất bằng phương trình này

ϵ(280) (M⁻¹ cm⁻¹) = (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).

Các giá trị ε(280) này khá đáng tin cậy cho những protein chứa các dư lượng Trp, và ít đáng tin cậy hơn cho các protein không chứa. Tuy nhiên, phương pháp Edelhoch là thuận tiện và chính xác, và cách tiếp cận tốt nhất là đo thay vì dự đoán ε.

Trong bài báo này, một phương pháp mới được mô tả nhằm phân biệt giữa các vùng cấu trúc protein được xác định đúng và sai dựa trên các tương tác nguyên tử đặc trưng. Các loại nguyên tử khác nhau được phân bố không ngẫu nhiên với nhau trong các phân tử protein. Những sai sót trong việc xây dựng mô hình dẫn đến việc phân bố các loại nguyên tử khác nhau trở nên ngẫu nhiên hơn, điều này có thể được phân biệt so với các phân bố đúng bằng các phương pháp thống kê.

Các nguyên tử được phân loại vào một trong ba loại: carbon (C), nitơ (N), và oxy (O). Điều này dẫn đến sáu tổ hợp khác nhau của các tương tác không liên kết cặp (CC, CN, CO, NN, NO, và OO). Một hàm lỗi bậc hai được sử dụng để đặc trưng hóa bộ các tương tác cặp từ các cửa sổ trượt chín dư trong cơ sở dữ liệu của 96 cấu trúc protein đáng tin cậy. Các vùng của cấu trúc protein ứng viên mà bị theo dõi sai hoặc đăng ký sai sau đó có thể được xác định thông qua phân tích mô hình của các tương tác không liên kết từ mỗi cửa sổ.

Cấu trúc protein trong Ngân hàng Dữ liệu Protein cung cấp nhiều dữ liệu về các tương tác xác định trạng thái nguyên bản của protein. Sử dụng lý thuyết xác suất, chúng tôi xây dựng một tiềm năng thống kê phụ thuộc vào khoảng cách nguyên tử dựa trên một mẫu cấu trúc nguyên bản mà không phụ thuộc vào bất kỳ thông số điều chỉnh nào (Tiềm năng Năng lượng Protein Tối ưu rời rạc, hay DOPE). DOPE được dựa trên một trạng thái tham chiếu cải tiến tương ứng với các nguyên tử không tương tác trong một hình cầu đồng nhất với bán kính phụ thuộc vào cấu trúc nguyên bản mẫu; do đó, nó tính đến hình dạng hữu hạn và hình cầu của các cấu trúc nguyên bản. Tiềm năng DOPE đã được rút trích từ một tập hợp cấu trúc tinh thể không dư thừa gồm 1472 cấu trúc. Chúng tôi đã kiểm tra DOPE và năm hàm điểm số khác bằng cách phát hiện trạng thái nguyên bản trong sáu bộ giả mẫu đa đích, mối tương quan giữa điểm số và lỗi mô hình, và xác định cấu trúc không nguyên bản chính xác nhất trong bộ giả mẫu. Đối với tất cả các bộ giả mẫu, DOPE là hàm hoạt động tốt nhất theo tất cả các tiêu chí, ngoại trừ một tiêu chí có sự hòa nhau cho một bộ giả mẫu. Để tạo điều kiện cho việc sử dụng nó trong các ứng dụng khác nhau, như đánh giá mô hình, mô hình vòng, và phù hợp vào bản đồ mật độ khối lượng cryo-điện tử kết hợp với mô hình hóa cấu trúc protein so sánh, DOPE đã được tích hợp vào gói mô hình MODELLER-8.

Thioflavine T (ThT) liên kết nhanh chóng với các sợi kết tụ của các peptide được chiết xuất từ β/A4, cụ thể là β(1–28) và β(1–40), tạo ra một cực đại hấp thụ (ex) mới tại 450 nm và phát xạ (em) gia tăng ở 482 nm, khác với các giá trị 385 nm (ex) và 445 nm (em) của thuốc nhuộm tự do. Sự thay đổi này phụ thuộc vào trạng thái kết tụ vì các peptide monomer hoặc dimer không phản ứng, và sự phân ly guanidine của các chuỗi kết tụ làm mất tín hiệu. Không có ảnh hưởng của nồng độ muối cao. Liên kết với β(1–40) có ái lực thấp hơn, K_d 2 μM, trong khi nó bão hòa với K_d là 0.54 μM cho β(1–28). Các sợi insulin chuyển đổi thành cấu hình β-sheet phát huỳnh quang mạnh mẽ với ThT. Một loạt các vật liệu polyhydroxy, polyanionic hoặc polycationic không tương tác hoặc cản trở sự tương tác với các peptide amyloid. Kỹ thuật huỳnh quang này sẽ cho phép làm sáng tỏ động học của quá trình lắp ráp sợi amyloid cũng như kiểm tra các tác nhân có thể điều chỉnh sự lắp ráp hoặc tháo rời của chúng.

Dự đoán cấu trúc protein so sánh chủ yếu bị hạn chế bởi các lỗi trong việc căn chỉnh và mô hình hóa vòng. Chúng tôi giới thiệu một kỹ thuật mô hình hóa tự động mới, giúp cải thiện đáng kể độ chính xác của dự đoán vòng trong cấu trúc protein. Vị trí của tất cả các nguyên tử không hydro trong vòng được tối ưu hóa trong một môi trường cố định với một hàm năng lượng giả. Năng lượng là tổng của nhiều ràng buộc không gian, bao gồm độ dài liên kết, góc liên kết, và các thuật ngữ góc dihedral không chính xác từ miền lực CHARMM‐22, các sở thích thống kê cho các góc dihedral của chuỗi chính và chuỗi phụ, và các sở thích thống kê cho các tiếp xúc nguyên tử không liên kết, phụ thuộc vào hai loại nguyên tử, khoảng cách giữa chúng trong không gian, và khoảng cách trong chuỗi. Hàm năng lượng được tối ưu hóa bằng phương pháp gradient liên hợp kết hợp với động lực học phân tử và tôi luyện mô phỏng. Thông thường, cấu hình vòng dự đoán tương ứng với cấu hình năng lượng thấp nhất trong số 500 lần tối ưu hóa độc lập. Các dự đoán được thực hiện cho 40 vòng có cấu trúc đã biết ở mỗi chiều dài từ 1 đến 14 amino acid. Độ chính xác của các dự đoán vòng được đánh giá dựa trên mức độ đầy đủ của mẫu hình thái, chiều dài vòng, và các thuộc tính cấu trúc của các vòng tự nhiên. Khi độ chính xác được đo bằng sự chồng lấp cục bộ của mô hình lên vòng tự nhiên, 100%, 90%, và 30% của các dự đoán vòng dài 4, 8, và 12 amino acid, tương ứng, có sai số RMSD < 2 Å cho các nguyên tử N, Ca, C, và O của chuỗi chính; các độ chính xác trung bình lần lượt là 0,59 ± 0,05, 1,16 ± 0,10, và 2,61 ± 0,16 Å. Để mô phỏng các vấn đề mô hình so sánh thực tế, phương pháp này cũng được đánh giá qua việc dự đoán các vòng có cấu trúc đã biết trong chỉ các môi trường tương đối chính xác với các lỗi điển hình của mô hình so sánh mà không có sự căn chỉnh sai. Khi biến dạng RMSD của các nguyên tử thân chuỗi chính là 2,5 Å, sai số dự đoán vòng trung bình tăng thêm 180%, 25%, và 3% cho vòng dài 4, 8, và 12 amino acid, tương ứng. Độ chính xác của dự đoán năng lượng thấp nhất cho một vòng nhất định có thể được ước lượng từ sự biến thể cấu trúc giữa một số dự đoán năng lượng thấp. Giá trị tương đối của phương pháp hiện tại được đánh giá qua (1) việc so sánh với một trong các phương pháp thành công nhất đã được miêu tả trước đây, và (2) mô tả độ chính xác của nó trong các dự đoán mù gần đây về cấu trúc protein. Cuối cùng, cho thấy rằng độ chính xác trung bình của dự đoán chủ yếu bị giới hạn bởi độ chính xác của hàm năng lượng, chứ không phải là phạm vi của mẫu hình thái.

Vật liệu thử nghiệm tích lũy trong tài liệu về hành vi cấu hình của protein không cấu trúc tự nhiên (protein không gấp tự nhiên) đã được phân tích. Kết quả của phân tích này cho thấy rằng những protein này không sở hữu các đặc tính cấu trúc đồng nhất, như mong đợi đối với các thành viên của một thực thể nhiệt động lực học đơn lẻ. Thay vào đó, các protein này có thể được chia thành hai nhóm cấu trúc khác nhau: cuộn nội tại và globule tiền nóng chảy. Các protein từ nhóm đầu tiên có kích thước thủy động học điển hình của cuộn ngẫu nhiên trong dung môi kém và không có (hoặc hầu như không có) cấu trúc thứ cấp có trật tự nào. Các protein từ nhóm thứ hai thì gọn hơn về mặt cấu trúc, thể hiện một lượng cấu trúc thứ cấp dư thừa, mặc dù chúng vẫn kém đặc hơn so với các protein globule tự nhiên hoặc nóng chảy. Một đặc điểm quan trọng của các protein không cấu trúc tự nhiên là chúng trải qua sự chuyển tiếp từ hỗn loạn sang trật tự trong hoặc trước khi thực hiện chức năng sinh học của chúng. Trong khía cạnh này, mô hình Bộ tứ Protein, với chức năng phát sinh từ bốn dạng cấu hình cụ thể (hình thức có trật tự, globule nóng chảy, globule tiền nóng chảy, và cuộn ngẫu nhiên) và sự chuyển tiếp giữa bất kỳ hai trạng thái nào, được thảo luận.

Giá trị biến tính m, sự phụ thuộc của năng lượng tự do của quá trình mở ra vào nồng độ chất biến tính, đã được thu thập cho một tập hợp lớn các protein. Giá trị m tương quan rất mạnh với lượng bề mặt protein tiếp xúc với dung môi khi mở ra, với hệ số tương quan tuyến tính R = 0.84 cho urê và R = 0.87 cho guanidin hydrochloride. Những tương quan này cải thiện lên R = 0.90 khi hiệu ứng của liên kết disulfide trên diện tích có thể tiếp cận của protein đã được mở ra được đưa vào. Một sự phụ thuộc tương tự vào diện tích bề mặt có thể tiếp cận đã được phát hiện trước đó cho sự thay đổi nhiệt dung (ΔC_p), điều này được xác nhận ở đây cho tập hợp protein của chúng tôi. Các giá trị m của chất biến tính và sự thay đổi nhiệt dung cũng tương quan tốt với nhau. Đối với các protein trải qua cơ chế mở ra đơn giản hai trạng thái, lượng bề mặt tiếp xúc với dung môi khi mở ra là một yếu tố cấu trúc chính cho cả giá trị m và ΔC_p.

We have carried out detailed statistical analyses of integral membrane proteins of the helix‐bundle class from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms for which genome‐wide sequence data are available. Twenty to 30% of all ORFs are predicted to encode membrane proteins, with the larger genomes containing a higher fraction than the smaller ones. Although there is a general tendency that proteins with a smaller number of transmembrane segments are more prevalent than those with many, uni‐cellular organisms appear to prefer proteins with 6 and 12 transmembrane segments, whereas Caenorhabditis elegansandHomo sapienshave a slight preference for proteins with seven transmembrane segments. In all organisms, there is a tendency that membrane proteins either have manytransmembrane segments with short connecting loops or few transmembrane segments with large extra‐membraneous domains. Membrane proteins from all organisms studied, except possibly the archaeon Methanococcus jannaschii, follow the so‐called “positive‐inside” rule; i.e., they tend to have a higher frequency of positively charged residues in cytoplasmic than in extra‐cytoplasmic segments.

PDBsum là một máy chủ web cung cấp thông tin cấu trúc về các mục trong Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB). Các phân tích chủ yếu dựa trên hình ảnh và bao gồm cấu trúc bậc hai của protein, tương tác giữa protein và ligand, tương tác giữa protein và DNA, phân tích PROCHECK về chất lượng cấu trúc, và nhiều phân tích khác. Các cấu trúc 3D có thể được xem tương tác trong RasMol, PyMOL, và một trình xem JavaScript có tên là 3Dmol.js. Người dùng có thể tải lên các tệp PDB của riêng họ và nhận một tập hợp các phân tích PDBsum được bảo vệ bằng mật khẩu cho mỗi tệp. Máy chủ này hoàn toàn miễn phí và có thể truy cập cho tất cả mọi người tại: http://www.ebi.ac.uk/pdbsum.

Một phương pháp mới dựa trên sự phân mảnh protein và độ phân giải cao của sắc ký lỏng nối trực tiếp với phổ khối ion hóa bằng bom nguyên tử nhanh (HPLC‐FABMS) được mô tả để xác định tốc độ mà hydro amide trong protein trải qua quá trình trao đổi đồng vị. Cytochrom c của tim ngựa được ủ trong D₂O tùy theo thời gian và nhiệt độ để thực hiện quá trình trao đổi đồng vị, sau đó chuyển sang điều kiện trao đổi chậm (pH 2–3, 0 °C) và được phân mảnh bằng pepsin. Số lượng deuteron amide peptide có trong các peptide thủy phân được suy luận từ trọng lượng phân tử của chúng, được xác định sau khi phân tích sự tiêu hóa bằng HPLC‐FABMS. Các kết quả hiện tại cho thấy rằng tốc độ trao đổi của hydro amide trong cytochrom c dao động từ rất nhanh (k > 140 h⁻¹) đến rất chậm (k < 0.002 h⁻¹). Hàm lượng deuterium của các đoạn cụ thể của protein được xác định tùy theo nhiệt độ ủ và được sử dụng để chỉ ra sự tham gia của các đoạn này vào các thay đổi cấu hình liên quan đến việc làm nóng cytochrom c. Đối với hệ thống HPLC‐FABMS hiện tại, khoảng 5 nmol protein đã được sử dụng cho mỗi lần xác định. Các kết quả của cuộc điều tra này chỉ ra rằng sự kết hợp giữa phân mảnh protein và HPLC‐FABMS tương đối không bị các ràng buộc liên quan đến các phương pháp phân tích khác được sử dụng cho mục đích này và có thể là một phương pháp chung để xác định tốc độ trao đổi hydro trong các đoạn cụ thể của protein.