Protein Science

We have developed and experimentally tested a novel computational approach for the de novo design of hydrophobic cores. A pair of computer programs has been written, the first of which creates a “custom” rotamer library for potential hydrophobic residues, based on the backbone structure of the protein of interest. The second program uses a genetic algorithm to globally optimize for a low energy core sequence and structure, using the custom rotamer library as input. Success of the programs in predicting the sequences of native proteins indicates that they should be effective tools for protein design.

Using these programs, we have designed and engineered several variants of the phage 434 cro protein, containing five, seven, or eight sequence changes in the hydrophobic core. As controls, we have produced a variant consisting of a randomly generated core with six sequence changes but equal volume relative to the native core and a variant with a “minimalist” core containing predominantly leucine residues. Two of the designs, including one with eight core sequence changes, have thermal stabilities comparable to the native protein, whereas the third design and the minimalist protein are significantly destabilized. The randomly designed control is completely unfolded under equivalent conditions. These results suggest that rational de novo design of hydrophobic cores is feasible, and stress the importance of specific packing interactions for the stability of proteins. A surprising aspect of the results is that all of the variants display highly cooperative thermal denaturation curves and reasonably dispersed NMR spectra. This suggests that the non‐core residues of a protein play a significant role in determining the uniqueness of the folded structure.

Chúng tôi đã nghiên cứu sự kết tụ không tự nhiên của yếu tố kích thích thuộc địa bạch cầu trung tính tái tổ hợp ở người (rhGCSF) trong các điều kiện dung dịch mà rhGCSF tự nhiên vừa ổn định về cấu hình so với trạng thái không gấp gọn vừa có nồng độ thấp hơn giới hạn hòa tan của nó. Quá trình kết tụ của rhGCSF đầu tiên liên quan đến việc ảnh hưởng đến cấu trúc tự nhiên của nó để hình thành một trạng thái chuyển tiếp mở rộng về mặt cấu trúc, sau đó là quá trình lắp ráp để hình thành một tập hợp không thể đảo ngược. Rào cản năng lượng của hai bước này được phản ánh trong các giá trị năng lượng tự do thực nghiệm của sự không gấp gọn (ΔG_unf) và hệ số virial thứ hai thẩm thấu (B₂₂), tương ứng. Dưới các điều kiện dung dịch mà sự ổn định cấu hình của rhGCSF chiếm ưu thế (tức là, ΔG_{unf lớn và B22 âm), bước đầu tiên là bước giới hạn tỷ lệ, và việc tăng cường ΔGunf (ví dụ, bằng cách thêm saccarozơ) làm giảm sự kết tụ. Trong các dung dịch mà sự ổn định keo cao (tức là, giá trị B22 lớn và dương), bước thứ hai là bước giới hạn tỷ lệ, và các điều kiện dung dịch (ví dụ, pH thấp và độ dẫn điện thấp) làm tăng sự tương tác đẩy giữa các phân tử protein có hiệu quả trong việc giảm sự kết tụ. Sự kết tụ của rhGCSF do đó được kiểm soát bởi cả sự ổn định cấu hình và sự ổn định keo, và tùy thuộc vào các điều kiện dung dịch, một trong hai thứ có thể là bước giới hạn tỷ lệ.}

Glutathione S‐transferases (GSTs) là những protein dimmer có vai trò quan trọng trong việc giải độc tế bào. Bốn GST từ loài muỗi Anopheles dirus B (Ad), một vector sốt rét quan trọng ở Đông Nam Á, được sản xuất từ việc cắt tách phiên mã của một sản phẩm duy nhất và trước đây đã được chứng minh là có hoạt động giải độc đối với các loại thuốc trừ sâu như DDT. Chúng tôi đã xác định cấu trúc tinh thể của hai trong số các protein cắt tách này, AdGST1–3 (kết hợp với glutathione) và AdGST1–4 (dạng apo), với độ phân giải lần lượt là 1.75 và 2.45 Å. Các isozyme GST này cho thấy sự khác biệt so với GST liên quan từ ruồi cừu Úc Lucilia cuprina; đặc biệt, sự hiện diện của một α-helix C tận đóng vai trò là một phần của vị trí hoạt động. α-helix này khiến vị trí hoạt động của GST Anopheles bị bao kín. α-helix liên kết glutathione α2 và các dư lượng xung quanh có dạng không có trật tự trong cấu trúc AdGST1–4 (apo), nhưng có trật tự trong cấu trúc AdGST1–3 (liên kết với GSH), gợi ý rằng GST ở côn trùng hoạt động theo cơ chế phù hợp cảm ứng tương tự như cơ chế tìm thấy ở các GST phi- và pi- lớp ở thực vật và người. Mặc dù có độ đồng nhất chuỗi tổng thể cao, nhưng các dư lượng vị trí hoạt động của AdGST1–4 và AdGST1–3 có các kiểu hình khác nhau.

Cấu trúc của phthalate dioxygenase reductase (PDR), một flavoprotein đơn phân chứa sắt - lưu huỳnh, có chức năng cung cấp electron từ NADH đến phthalate dioxygenase, được so sánh với ferredoxin‐NADP⁺ reductase (FNR) và ferredoxin, các protein có vai trò khử NADP⁺ trong phản ứng cuối cùng của photosystem I. Các mô hình gập của các miền liên kết flavin, NAD(P) và [2Fe‐2S] là rất tương đồng trong hai hệ thống này. Sự căn chỉnh các cấu trúc X‐ray của PDR và FNR hỗ trợ việc xác định các đặc trưng đặc trưng cho một họ flavoprotein reductases mà các thành viên bao gồm cytochrome P‐450 reductase, sulfite và nitrate reductases, cùng với nitric oxide synthase. Những đặc điểm nổi bật của nhánh flavoprotein này, được gọi là họ FNR, là một thùng β song song ngược liên kết nhóm prosthetic flavin và một biến thể đặc trưng của kiểu gập nucleotide pyridine cổ điển. Mặc dù có sự tương đồng giữa FNR và PDR, những cố gắng để lập mô hình cấu trúc của phức hợp FNR:ferredoxin phân ly bằng cách so sánh với PDR lại chỉ ra những đặc điểm mâu thuẫn với các nghiên cứu về liên kết hóa học (Zanetti, G., Morelli, D., Ronchi, S., Negri, A., Aliverti, A., & Curti, B., 1988, Biochemistry 27, 3753–3759).

Các khác biệt trong các vị trí liên kết flavin và nucleotide pyridine xác định tính đặc hiệu nucleotide của FNR và PDR. Tính đặc hiệu của FNR đối với NADP⁺ chủ yếu do các thay thế trong FNR mà tạo điều kiện thuận lợi cho các tương tác với phosphate 2′ của NADP⁺. Các biến thể trong cấu hình và trình tự của vòng tiếp giáp với phosphate flavin ảnh hưởng đến sự chọn lọc cho FAD so với FMN.

Các tiềm năng giữa cho sự khử flavin và [2Fe–2S] trong PDR cao hơn so với các đồng thể trong FNR và ferredoxin rau chân vịt, khoảng 120 mV và 260 mV, tương ứng. So sánh cấu trúc của PDR với FNR rau chân vịt và với ferredoxin từ Anabaena 7120, cùng với tính toán các tiềm năng tĩnh điện, gợi ý rằng các tương tác cục bộ, bao gồm cả liên kết hydro, là yếu tố đóng góp chủ yếu vào những khác biệt này trong tiềm năng.

Chúng tôi áp dụng một phương pháp đơn giản để căn chỉnh các trình tự protein dựa trên cấu trúc 3D, quy mô lớn, cho các protein trong phân loại scop của các gia đình gập. Điều này cho phép chúng tôi đánh giá, hiểu và cải thiện phương pháp tự động của mình so với một tiêu chuẩn thủ công được xây dựng một cách khách quan, một loại đánh giá toàn diện mà chưa có thể thực hiện cho các thuật toán căn chỉnh cấu trúc khác. Cách tiếp cận cơ bản của chúng tôi trực tiếp ghép nối khung xương của hai cấu trúc, sử dụng các chu trình lặp đi lặp lại của lập trình động và điều chỉnh bình phương nhỏ nhất để xác định một sự căn chỉnh giảm thiểu sự khác biệt tọa độ. Nhờ vào sự đơn giản, phương pháp của chúng tôi có thể dễ dàng điều chỉnh để xem xét các đặc điểm bổ sung của cấu trúc protein như định hướng của chuỗi bên hoặc chi phí mở một khoảng trống phụ thuộc vào vị trí. Phương pháp cơ bản của chúng tôi, được mở rộng bởi những điều chỉnh như vậy, có thể tìm thấy các sự căn chỉnh hợp lý cho tất cả ngoài 1,5% các tương đồng cấu trúc đã biết trong scop, tức là tất cả ngoài 32 trong số 2,107 cặp siêu gia đình. Chúng tôi thảo luận về các đặc điểm cấu trúc protein cụ thể làm cho 32 cặp này rất khó căn chỉnh và cho thấy cách quy trình của chúng tôi phân chia hiệu quả các mối quan hệ trong scop thành những loại khác nhau, tùy thuộc vào các khía cạnh của cấu trúc protein có liên quan (ví dụ, phụ thuộc vào việc liệu có cần cân nhắc đến định hướng chuỗi bên hay không để căn chỉnh chính xác). Chúng tôi cũng cho thấy cách quy trình căn chỉnh cặp của chúng tôi có thể được mở rộng để tạo ra một căn chỉnh đa chiều cho một nhóm các cấu trúc liên quan. Chúng tôi đã so sánh các căn chỉnh này một cách chi tiết với các căn chỉnh thủ công tương ứng lấy từ tài liệu. Chúng tôi thấy sự đồng thuận tốt (trong vòng 95% cho các vùng lõi), và so sánh chi tiết nổi bật cách những đặc điểm cấu trúc protein cụ thể (như một số sợi nhất định) gây khó khăn cho việc căn chỉnh, dẫn đến kết quả có phần không rõ ràng. Với những cải tiến và kiểm tra có hệ thống này, quy trình của chúng tôi sẽ hữu ích cho sự phát triển của scop và phân loại tương lai của các kiểu gập protein. Tài liệu bổ sung có sẵn tại http://bioinfo.mbb.yale.edu/align.

Cấu trúc của các dạng oxi hóa và khử của rubredoxin từ vi khuẩn cổ đại Pyrococcus furiosus, một sinh vật phát triển tối ưu ở nhiệt độ 100 °C, đã được xác định bằng kỹ thuật tinh thể X‐ray với độ phân giải 1.8 Å. Các tinh thể rubredoxin này phát triển trong nhóm không gian P2₁2₁2₁ với kích thước tế bào ở nhiệt độ phòng a = 34.6 Å, b = 35.5 Å, và c = 44.4 Å. Các pha ban đầu được xác định bằng phương pháp thay thế phân tử, sử dụng dạng oxi hóa của rubredoxin từ vi khuẩn eubacterium có nhiệt độ tối ưu Clostridium pasteurianum làm mẫu khởi đầu. Các mô hình oxi hóa và khử của rubredoxin P. furiosus đều chứa 414 nguyên tử protein không chứa hydro, tương ứng với 53 dư lượng. Mô hình của dạng oxi hóa chứa 61 nguyên tử oxy nước H₂O và đã được tinh chỉnh bằng X‐PLOR và TNT đến R = 0.178 với độ lệch trung bình căn bậc hai (rms) từ lý tưởng trong khoảng cách liên kết và góc liên kết là 0.014 Å và 2.06°, tương ứng. Mô hình của dạng khử chứa 37 nguyên tử oxy nước H₂O và đã được tinh chỉnh đến R = 0.193 với độ lệch rms từ lý tưởng trong chiều dài liên kết là 0.012 Å và trong góc liên kết là 1.95°. Cấu trúc tổng thể của rubredoxin P. furiosus tương tự như cấu trúc của các rubredoxin sống trong điều kiện nhiệt độ trung bình, ngoại trừ một mạng lưới liên kết hydro rộng hơn trong vùng β-sheet và nhiều tương tác tĩnh điện (cầu muối, liên kết hydro) của chuỗi bên Glu 14 với các nhóm trên ba dư lượng khác (nitơ đầu amine của Ala 1; nitơ indole của Trp 3; và nhóm nitơ amide của Phe 29). Ảnh hưởng của những tính năng này và những yếu tố khác đối với sự ổn định nhiệt độ của protein P. furiosus cũng được thảo luận.

Chúng tôi đã xác định một động thái phosphatase mới, có thể bảo tồn, mô hình chuỗi KXXXXXXRP‐(X_12‐54)‐PSGH‐(X_31‐54))‐SRXXXXX HXXXD, được chia sẻ trong một số phosphatase lipid, phosphatase glucose‐6 của động vật có vú, và một tập hợp các phosphatase acid không chuyên biệt từ vi khuẩn. Chuỗi này cũng được tìm thấy trong chloroperoxidase chứa vanadi của Curvularia inaequalis. Nhiều bằng chứng hỗ trợ việc xác định mô hình phosphatase này. Dữ liệu cấu trúc tinh thể về chloroperoxidase cho thấy rằng cả ba miền đều ở gần nhau và một số dư lượng bảo tồn tham gia vào việc liên kết với cofactor, vanadate, một hợp chất có cấu trúc tương tự như phosphate. Phân tích cấu trúc-chức năng của phosphatase glucose‐6 ở người đã cho thấy rằng hai trong số các dư lượng bảo tồn (arginine miền đầu tiên và histidine miền trung tâm) là thiết yếu cho hoạt động của enzyme. Mô hình chuỗi bảo tồn này đã được sử dụng để xác định chín phosphatase tiềm năng bổ sung từ các cơ sở dữ liệu chuỗi, trong đó một trong số đó đã được xác định là một phosphatase lipid trong nấm men.

Cấu trúc Polyproline II (PPII) được báo cáo là cấu trúc chiếm ưu thế trong trạng thái chưa gập của các peptide, ngay cả khi không có proline trong chuỗi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nhiệt lượng kế titration isothermal (ITC) để điều tra định hướng PPII trong trạng thái chưa gập bằng cách nghiên cứu sự liên kết của miền SH3 của SEM‐5 với các biến thể của ligand peptide PPII tiềm năng của nó, Sos. Hệ thống thí nghiệm độc đáo ở chỗ nó cho phép tiếp cận trực tiếp với sự thay đổi entropi cấu hình của các axit amin thay thế. Kết quả cho thấy tập hợp biến tính có thể được phân loại bởi ít nhất hai trạng thái nhiệt động lực học khác nhau, cấu trúc PPII và một trạng thái chưa gập phù hợp với ý tưởng trước đây về trạng thái biến tính như một tập hợp ngẫu nhiên của các cấu trúc được xác định chủ yếu bởi sự va chạm của các hình cầu cứng. Xác suất của cấu trúc PPII trong các trạng thái biến tính cho Ala và Gly được phát hiện là đáng kể, ~30% và ~10% tương ứng, dẫn đến sự giảm mạnh trong entropi cấu hình của việc gập.

Cấu trúc tinh thể X-quang của yếu tố chuyển glutaminase XIII của người đã tiết lộ một vị trí hoạt động giống như proteinase cysteine liên quan đến một phản ứng liên kết chéo và không phải phân giải protein. Đây là một trong những quan sát đầu tiên về các vị trí hoạt động tương tự trong 2 nhóm enzyme khác nhau xúc tác cùng một phản ứng nhưng theo hướng ngược lại. Mặc dù kích thước và hình dạng tổng thể của yếu tố XIII và các proteinase cysteine là khá khác nhau, nhưng vị trí hoạt động và cấu trúc protein xung quanh chia sẻ các đặc điểm cấu trúc cho thấy một nguồn gốc tiến hóa chung. Ở đây, chúng tôi trình bày mô tả về các dư lượng trong vị trí hoạt động và bằng chứng cấu trúc cho thấy cơ chế xúc tác của các chuyển glutaminase tương tự như cơ chế trái chiều của các proteinase cysteine.

Polyglutamine expansions, leading to aggregation, have been implicated in various neurodegenerative disorders. The range of repeats observed in normal individuals in most of these diseases is 19–36, whereas mutant proteins carry 40–81 repeats. In one such disorder, spinocerebellar ataxia (SCA1), it has been reported that certain individuals with expanded polyglutamine repeats in the disease range (Q₁₂HQHQ₁₂HQHQ_14/15) but with histidine interruptions were found to be phenotypically normal. To establish the role of histidine, a comparative study of conformational properties of model peptide sequences with (Q₁₂HQHQ₁₂HQHQ₁₂) and without (Q₄₂) interruptions is presented here. Q₁₂HQHQ₁₂HQHQ₁₂ displays greater solubility and lesser aggregation propensity compared to uninterrupted Q₄₂ as well as much shorter Q₂₂. The solvent and temperature‐driven conformational transitions (β structure ↔ random coil → α helix) displayed by these model polyQ stretches is also discussed in the present report. The study strengthens our earlier hypothesis of the importance of histidine interruptions in mitigating the pathogenicity of expanded polyglutamine tract at the SCA1 locus. The relatively lower propensity for aggregation observed in case of histidine interrupted stretches even in the disease range suggests that at a very low concentration, the protein aggregation in normal cells, is possibly not initiated at all or the disease onset is significantly delayed. Our present study also reveals that besides histidine interruption, proline interruption in polyglutamine stretches can lower their aggregation propensity.