Biotechnology and Applied Biochemistry

Protein β‐casein biến đổi (mβ‐CN) đã được nghiên cứu như một phụ gia hiệu quả cho khả năng hồi phục nhiệt của carbonic anhydrase II ở người (HCA II) tại pH 7.75. mβ‐CN được tạo ra thông qua việc biến đổi các gốc axit của β‐casein (β‐CN) bằng cách sử dụng thuốc thử Woodward K. Các tác động của mβ‐CN đối với khả năng hồi phục và độ ổn định của HCA II được xác định bằng các phương pháp quang phổ nhiệt quét khác nhau, UV–vis, và phương pháp quang phổ huỳnh quang 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid. mβ‐CN, với tư cách là một phụ gia, đã tăng cường khả năng hồi phục nhiệt của HCA II lên 33%. Tổng thể, các kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng mβ‐CN rất hiệu quả trong việc giảm sự kết tụ nhiệt và tăng cường độ ổn định của HCA II. Sử dụng các nghiên cứu lý thuyết, chúng tôi đề xuất rằng cơ chế hồi phục nhiệt được trung gian hóa thông qua sự hình thành cầu muối giữa phần Woodward của mβ‐CN và ion Zn của HCA II.

Hồng cầu lưỡi liềm thể hiện khuynh hướng bất thường trong việc bám dính với tế bào nội mạch động mạch chủ bò khi so với hồng cầu bình thường. Sự bám dính này đã được tăng cường gấp ba lần bởi môi trường điều kiện lấy từ tế bào nội mạch, được bổ sung bởi các đa phân tử của yếu tố von Willebrand. Sự bám dính này đã giảm 80% khi sử dụng peptide tổng hợp (RGDS) hoặc kháng thể đối với GPIIb/IIIa, cho thấy sự hiện diện của miền nhận dạng/receptor peptide RGD trong tế bào nội mạch, tế bào hồng cầu lưỡi liềm, hoặc cả hai. Sự bám dính cũng bị ức chế 70% bởi phosphatidylserine, nhưng không bởi các phospholipid khác, cho thấy sự hiện diện của các receptor tiềm tàng cho phospholipid này trong tế bào nội mạch. Việc đánh dấu tế bào nội mạch động mạch chủ bò nuôi cấy bằng các kháng thể đơn dòng đã tiết lộ sự định vị của MAB D2 tại các vùng tiếp xúc giữa các tế bào. Kháng nguyên trên tế bào nội mạch phản ứng chéo với kháng thể này có khối lượng phân tử là 130.000. Việc thêm kháng thể này trong quá trình tạo lớp tế bào nội mạch đã làm gián đoạn sự hình thành lớp đơn. Có vẻ như một kháng nguyên polypeptide 130-kDa trong tế bào nội mạch được MAB D2 nhận diện, có thể là một phân tử liên kết giữa các tế bào.

Các chất thải từ môi trường con người thường chứa kháng sinh và các gen kháng kháng sinh (ARGs) có thể làm ô nhiễm môi trường tự nhiên; hậu quả rõ ràng nhất của việc này là sự chọn lọc các vi khuẩn kháng kháng sinh. Biển Baltic là hồ nước lợ bị cô lập lớn thứ hai trên Trái Đất, phục vụ như một khu vực thoát nước cho người dân ở 14 quốc gia, mỗi quốc gia có chính sách sử dụng kháng sinh và xử lý nước thải khác nhau. Mục tiêu của nghiên cứu này là đặc trưng hóa cấu trúc vi sinh vật phù du và định lượng các ARGs (tetA, tetB, tetM, ermB, sul1, blaSHV, và ampC) trong cộng đồng vi sinh vật phù du của Biển Baltic. Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase định lượng được áp dụng để định lượng ARGs từ bốn địa điểm mẫu khác nhau của Biển Baltic trong suốt 2 năm, và cộng đồng vi khuẩn được phân tích thông qua giải trình tự vùng V6 của gen 16S rRNA trên Illumina HiSeq2000. Kết quả cho thấy tất cả các gen kháng thuốc nhắm đến trong nghiên cứu đều có thể phát hiện được từ vi sinh vật phù du của Biển Baltic. Tỷ lệ gen tetA, tetB, tetM, ermB, và sul1 trong cộng đồng vi khuẩn biển dao động từ 0,0077% đến 0,1089%, 0,0003% đến 0,0019%, 0,0001% đến 0,0105%, 0% đến 0,0136%, và 0,0001% đến 0,0438%, tương ứng. Gen tetA được phát hiện nhiều nhất và nó cũng chiếm tỷ lệ cao nhất trong toàn bộ cộng đồng vi sinh vật. Một mối tương quan mạnh giữa dữ liệu về sự phong phú của ARG vi sinh vật phù du và cấu trúc hệ sinh thái đã được tìm thấy, điều này ngụ ý rằng sự phong phú của hầu hết các ARG được nghiên cứu trong Biển Baltic được xác định bởi sự biến động trong cấu trúc cộng đồng vi khuẩn của nó.

Bài tổng quan này tóm tắt những tiến bộ gần đây trong sinh lý học và đa dạng sinh học vi sinh vật liên quan đến việc loại bỏ nitơ oxit (NO_x) từ các chất ô nhiễm khí. Một cái nhìn tổng quan ngắn gọn được đưa ra về các công nghệ hóa học gần đây và tiềm năng công nghệ sinh học cho việc loại bỏ NO_x từ khí thải: các quá trình vi sinh vật liên quan đến việc loại bỏ NO_x [khử nitrat hiếu khí, khử nitrat kích thích bằng hydro và khử nitrat nhiệt độ cao; oxy hóa kỵ khí của amoni (NH₄⁺), các quá trình nitrification và khử nitrat kết hợp]; chuyển hóa oxit nitric của các vi khuẩn khử nitrat và các vi sinh vật khác; phản ứng của oxit nitric ở nhiệt độ cao hơn; kết hợp các quá trình loại bỏ nitơ và lưu huỳnh. Bài tổng quan này được nhằm đến các nhà công nghệ sinh học, hóa sinh, vi sinh học và sinh lý học.

Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá tác động cộng thêm của yếu tố tăng trưởng chuyển đổi beta3 (TGF‐β3) và axit hyaluronic (HA) đến sự biệt hóa thành sụn của tế bào gốc trung mô người (hMSCs). Các hMSCs được nuôi cấy trên đĩa nuôi cấy tế bào được phủ collagen loại I, HA, hoặc fibronectin với hoặc không có sự bổ sung TGF‐β3 vào môi trường nuôi cấy. Bốn tuần sau khi nuôi cấy tế bào, sự biệt hóa thành sụn của hMSCs được xác định bằng cách đánh giá sự biểu hiện của các dấu ấn đặc hiệu cho sụn bằng phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực, kỹ thuật nhuộm miễn dịch tế bào, và phân tích Western blot. Các hMSCs được nuôi cấy trên đĩa phủ HA với sự bổ sung TGF‐β3 cho thấy sự tăng cường rõ rệt về collagen loại II, aggrecan và Sox9. Khi các hMSCs được nuôi cấy mà không có sự bổ sung TGF‐β3, chỉ có các hMSCs được nuôi cấy trên đĩa phủ HA mới cho thấy sự biểu hiện rõ rệt của các dấu ấn đặc hiệu cho sụn. Nghiên cứu này cho thấy sự biệt hóa thành sụn của hMSCs có thể được tăng cường một cách cộng thêm thông qua các tương tác với cả một ma trận bám dính tế bào đặc hiệu và một yếu tố tăng trưởng tan trong.

Các chiến lược cho ăn khác nhau trong việc sản xuất interferon‐γ của người bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện kích thích bằng isopropyl β‐d‐thiogalactoside trong Escherichia coli BL21(DE3) (plasmid pET3a‐ifnγ) đã được nghiên cứu. Bốn chế độ cung cấp thức ăn theo đợt đã được thiết kế để so sánh ảnh hưởng của μ (tốc độ tăng trưởng riêng) đến sản xuất protein tái tổ hợp, tiêu thụ chất nền, hình thành sản phẩm phụ và độ ổn định của plasmid trong các môi trường nuôi cấy mật độ tế bào cao của E. coli. Kết quả cho thấy Y_p/s, sản lượng sản phẩm/chất nền của interferon‐γ bị ảnh hưởng đáng kể bởi μ trong suốt quá trình, nhưng sản lượng sản phẩm/sinh khối (Y_p/x) bị ảnh hưởng bởi μ ở giai đoạn trước khi kích thích. Bằng cách áp dụng một chiến lược cung cấp thức ăn hiệu quả, trong đó μ được duy trì ở mức tối đa có thể đạt được, protein tái tổ hợp đã tích lũy tới mức 60% tổng lượng protein tế bào và năng suất của nó đã được tăng lên đáng kể. Trong trường hợp này, tổng năng suất của sinh khối và protein tái tổ hợp lần lượt là 6.36 và 2.1, so với 1.91 và 0.16 g·h⁻¹·lít⁻¹ trong quá trình cho ăn theo hàm mũ, trong đó μ được giữ không đổi trong toàn bộ quá trình.

Tác động của glycerol và sorbitol đối với độ ổn định của trypsin niệu đầu heo đã được nghiên cứu trong công trình này. Kết quả mô phỏng động lực học phân tử và độ ổn định nhiệt cho thấy trypsin có hai vùng linh hoạt, và polyol (sorbitol và glycerol) ổn định enzyme bằng cách giảm tính linh hoạt của các vùng này. Kết quả hàm phân bố bán kính cho thấy sorbitol và glycerol bị loại trừ khỏi lớp nước đầu tiên của enzyme, do đó giảm tính linh hoạt của các vùng bằng cách loại trừ ưu tiên. Ngoài ra, kết quả cho thấy tác dụng ổn định của sorbitol mạnh hơn glycerol. Quan sát này có thể là do sự giảm lớn hơn trong sự dao động của trypsin khi có mặt sorbitol. Chúng tôi cũng đã nghiên cứu vai trò của tính kỵ nước của dung môi trong việc ổn định enzyme bởi sorbitol và glycerol. Để làm điều này, độ ổn định nhiệt của trypsin đã được đánh giá trong sự hiện diện của các dung môi có tính kỵ nước khác nhau (methanol, ethanol, isopropanol và n‐propanol) ngoài các polyol. Kết quả của chúng tôi cho thấy glycerol là một chất ổn định tốt hơn so với sorbitol trong sự hiện diện của các dung môi kỵ nước (n‐propanol), trong khi sorbitol là một chất ổn định tốt hơn glycerol trong sự hiện diện của các dung môi ưa nước (methanol).

Enzyme lipase đang được sử dụng ngày càng nhiều trong việc tổng hợp các trung gian thuốc và các phân tử quan trọng về dược lý cũng như trong việc phân giải các hỗn hợp racemic để thu nhận các enantiomer có hoạt tính sinh học. Alginate đã được sử dụng như một liên kết macroaffinity để tinh chế lipase từ Chromobacterium viscosum, tuyến tụy lợn và hạt lúa mì thông qua kỹ thuật lắng đọng liên kết. Trong tất cả các trường hợp, chế phẩm tinh khiết thể hiện một dải duy nhất trên SDS/PAGE. Quá trình này mang lại năng suất đầy đủ lần lượt là 87%, 75% và 62% cho lipase từ Chromobacterium, lợn và hạt lúa mì. Alginate cũng được tìm thấy là chất kích hoạt các enzyme; hiệu ứng này gây ấn tượng nhất trong trường hợp lipase hạt lúa mì, nơi mà sự tăng cường hoạt động được quan sát thấy lên tới 4-5 lần. Hơn nữa, alginate cũng bảo vệ enzyme khỏi sự bất hoạt do nhiệt độ.

Việc immobil hóa các protein thường dẫn đến sự định hướng ngẫu nhiên của các phân tử trên bề mặt của vật liệu mang, do đó việc giải thích cơ chế của những thay đổi trong các tính chất, chẳng hạn như độ ổn định nhiệt, trở nên rất khó khăn. Gần đây, chúng tôi đã chuẩn bị một số enzyme đột biến của protease trung tính giống thermolysin từ Bacillus stearothermophilus, chứa các residu cysteine ở những vị trí khác nhau trên bề mặt của phân tử protein. Những enzyme này cho phép immobil hóa tại vị trí cụ thể đến Activated Thiol‐Sepharose và cho thấy rằng các hiệu ứng ổn định rất phụ thuộc vào vị trí gắn kết [Mansfeld, Vriend, Van den Burg, Eijsink và Ulbrich‐Hofmann (1999) Biochemistry 38, 8240–8245]. Sự ổn định lớn nhất được đạt được sau khi immobil hóa các enzyme đột biến S65C và T56C/S65C trong khu vực cấu trúc (các vị trí 56–69) nơi mà quá trình mở ra bắt đầu. Trong nghiên cứu này, động học bất hoạt nhiệt của hai enzyme đột biến này, cũng như của enzyme pseudo‐wild‐type và thermolysin, đã được so sánh cho các loại hình thức immobil hóa khác nhau. Bên cạnh việc immobil hóa tại vị trí cụ thể thông qua các nhóm thiol, các enzyme cũng được gắn kết ngẫu nhiên thông qua các nhóm amino của chúng hoặc bằng liên kết loại hỗn hợp. Ma trận cơ bản là Sepharose 4B trong tất cả các vật mang. Trong khi các enzyme gắn kết tại vị trí cụ thể với Activated Thiol‐Sepharose cho thấy động học bất hoạt bậc nhất rõ ràng như các enzyme tan, các chế phẩm enzyme được immobil hóa khác được đặc trưng bởi động học bất hoạt biphasic rõ ràng phản ánh sự không đồng nhất của các phân tử enzyme trên vật mang với respect đến quá trình mở ra nhiệt. Việc gắn kết tại vị trí cụ thể dẫn đến sự ổn định mạnh mẽ hơn so với loại gắn kết hỗn hợp. Tuy nhiên, việc immobil hóa vào một vật mang được chức năng hóa cao qua các nhóm amino đã tăng cường thêm sự ổn định, gợi ý rằng việc gắn kết nhiều ngoài khu vực mở ra 56–65 có thể tăng cường thêm sự ổn định của các phân tử enzyme.

Troponin I (TnI) là tiểu đơn vị ức chế của phức hợp troponin và là dấu hiệu sinh hóa đặc hiệu cho nhồi máu cơ tim (MI). Nó được giải phóng vào dòng máu trong vòng 4–6 giờ sau khi xảy ra MI, đạt đỉnh sau 18–24 giờ và duy trì nồng độ cao trong tối đa 7 ngày. Trong công trình này, tôi đã xác định các dạng TnI có mặt trong huyết thanh của bệnh nhân MI. Bằng cách cố định các kháng thể anti‐TnI nhận diện các vị trí epitope khác nhau trên phân tử TnI, chúng tôi đã có thể tách TnI từ các mẫu huyết thanh của bệnh nhân MI. Phân tích Western-blot sau SDS/PAGE cho thấy hai mảnh TnI chính với khối lượng phân tử hiển thị lần lượt là 18000 và 14000 Da. Một trong hai hoặc cả hai mảnh đều được quan sát trong huyết thanh của những người bị MI. Các mảnh này được hình thành do quá trình phân hủy proteolytic từ vùng C-ở tận cùng của TnI. Quá trình xử lý một phần từ N-ở tận cùng của TnI cũng được phát hiện và liên quan đến sự hình thành của mảnh 14000 Da. Rất ít TnI nguyên vẹn chưa xử lý được phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhân sau MI. Quá trình phân hủy in vitro của TnI tim đã được nghiên cứu bằng cách ủ TnI tái tổ hợp từ bò hoặc người trong huyết thanh. Các phân tích Western-blot với kháng thể TnI cho thấy rằng TnI tinh khiết được thêm vào huyết thanh người bình thường hoặc huyết thanh bệnh nhân MI đã được loại bỏ TnI phân hủy nhanh chóng thành các mảnh có khối lượng phân tử thấp hơn. Sự phân hủy của TnI có liên quan đến việc mất hoạt tính miễn dịch. TnI trong huyết thanh bị tách ra bởi kháng thể anti-TnI, trong điều kiện không tách rời, có liên quan đến ít nhất là troponin C (TnC) và troponin T (TnT). Phức hợp này được liên kết bởi các kháng thể anti-TnI, anti-TnC và anti-TnT.