Việc immobil hóa các protein thường dẫn đến sự định hướng ngẫu nhiên của các phân tử trên bề mặt của vật liệu mang, do đó việc giải thích cơ chế của những thay đổi trong các tính chất, chẳng hạn như độ ổn định nhiệt, trở nên rất khó khăn. Gần đây, chúng tôi đã chuẩn bị một số enzyme đột biến của protease trung tính giống thermolysin từ Bacillus stearothermophilus, chứa các residu cysteine ở những vị trí khác nhau trên bề mặt của phân tử protein. Những enzyme này cho phép immobil hóa tại vị trí cụ thể đến Activated Thiol‐Sepharose và cho thấy rằng các hiệu ứng ổn định rất phụ thuộc vào vị trí gắn kết [Mansfeld, Vriend, Van den Burg, Eijsink và Ulbrich‐Hofmann (1999) Biochemistry 38, 8240–8245]. Sự ổn định lớn nhất được đạt được sau khi immobil hóa các enzyme đột biến S65C và T56C/S65C trong khu vực cấu trúc (các vị trí 56–69) nơi mà quá trình mở ra bắt đầu. Trong nghiên cứu này, động học bất hoạt nhiệt của hai enzyme đột biến này, cũng như của enzyme pseudo‐wild‐type và thermolysin, đã được so sánh cho các loại hình thức immobil hóa khác nhau. Bên cạnh việc immobil hóa tại vị trí cụ thể thông qua các nhóm thiol, các enzyme cũng được gắn kết ngẫu nhiên thông qua các nhóm amino của chúng hoặc bằng liên kết loại hỗn hợp. Ma trận cơ bản là Sepharose 4B trong tất cả các vật mang. Trong khi các enzyme gắn kết tại vị trí cụ thể với Activated Thiol‐Sepharose cho thấy động học bất hoạt bậc nhất rõ ràng như các enzyme tan, các chế phẩm enzyme được immobil hóa khác được đặc trưng bởi động học bất hoạt biphasic rõ ràng phản ánh sự không đồng nhất của các phân tử enzyme trên vật mang với respect đến quá trình mở ra nhiệt. Việc gắn kết tại vị trí cụ thể dẫn đến sự ổn định mạnh mẽ hơn so với loại gắn kết hỗn hợp. Tuy nhiên, việc immobil hóa vào một vật mang được chức năng hóa cao qua các nhóm amino đã tăng cường thêm sự ổn định, gợi ý rằng việc gắn kết nhiều ngoài khu vực mở ra 56–65 có thể tăng cường thêm sự ổn định của các phân tử enzyme.
