Biotechnology and Applied Biochemistry

Iscom – phức hợp kích thích miễn dịch – là một cách chế tạo có tính miễn dịch cao từ các kháng nguyên màng vi sinh vật. Các thành phần của iscom đã được phân tích sinh hóa và bao gồm protein và glycoside Quil A. Phân tích tiếp theo về iscom cho thấy rằng phần protein – kháng nguyên – không đóng góp vào iscom dưới dạng cấu trúc. Thay vào đó, cholesterol và Quil A là những thành phần cấu trúc thiết yếu được sắp xếp lại với nhau thành một cấu trúc giống như lồng điển hình. Một lipid “động” hơn, chẳng hạn như phosphatidylcholine, là cần thiết để tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các polypeptide hoặc oligopeptide amphipathic vào ma trận iscom.

Khi dầu đậu nành thô được sử dụng làm nguồn sản xuất biodiesel, năng suất methyl ester thấp hơn đáng kể so với dầu đậu nành tinh chế. Sự khác biệt chính giữa dầu đậu nành tinh chế và thô được phát hiện là do hàm lượng phospholipid, acid tự do và nước, những yếu tố này có ảnh hưởng khác nhau đến sản xuất biodiesel. Hàm lượng phospholipid là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất; càng cao hàm lượng phospholipid trong dầu, năng suất methyl ester càng thấp. Hoạt độ nước tối ưu được phát hiện nằm trong khoảng từ 0.12 đến 0.44, và acid tự do có trong dầu đậu nành thô không cho thấy tác động tiêu cực đến quá trình chuyển este hóa enzym. Trong nghiên cứu ba bước methanol hóa dầu đậu nành thô để sản xuất biodiesel, chúng tôi nhận thấy rằng bước methanol hóa thứ hai nhanh hơn nhiều so với phản ứng ở bước đầu tiên. Dựa trên phát hiện này, đề xuất rằng việc tiền xử lý ngâm xúc tác lipase trong dầu giúp cải thiện hoạt động của enzyme đã được đưa ra. Bên cạnh đó, đã chứng minh rằng việc tiền xử lý ngâm xúc tác lipase trong dầu có thể cải thiện đáng kể cả tốc độ phản ứng và năng suất methyl ester. Năng suất methyl ester đạt được 94% bằng cách ngâm lipase trong dầu thô trong 120 giờ và con số này cũng cao ngang bằng với năng suất của dầu tinh chế.

TAP (tinh sạch liên hợp đồng thời) cho phép tách nhanh chóng và sạch sẽ một protein đã đánh dấu cùng với các đối tác tương tác của nó từ lysate tế bào. Ban đầu được phát triển trên nấm men, phương pháp TAP sau đó đã được thích ứng cho các tế bào và sinh vật khác. Khi kết hợp với phân tích MS, phương pháp này đã trở thành công cụ không thể thiếu cho việc xác định có hệ thống các phức hợp protein liên kết với mục tiêu. Đặc điểm chính của TAP là việc sử dụng một dấu ấn liên kết kép, được fusion vào protein quan tâm. Dấu ấn TAP ban đầu bao gồm hai đơn vị liên kết IgG của Protein A từ Staphylococcus aureus và peptide liên kết calmodulin. Khi kỹ thuật này được khai thác rộng rãi, một số dấu ấn TAP thay thế dựa trên các thiết bị liên kết khác đã được phát triển. Bài đánh giá hiện tại cung cấp cái nhìn tổng quan về các tổ hợp dấu ấn khác nhau cho TAP, nhấn mạnh những lựa chọn thay thế mang lại hiệu suất cải thiện hoặc tính năng độc đáo. Thông tin được cung cấp nên hỗ trợ trong việc lựa chọn và phát triển các dấu ấn TAP cho các ứng dụng cụ thể.

Trong bài báo hiện tại, chúng tôi trình bày một báo cáo so sánh về việc cố định lipase từ loài Bacillus trên các chất mang rắn khác nhau với các đặc tính bề mặt khác nhau và sự ổn định nhiệt của nó. Việc cố định đã nâng cao độ ổn định nhiệt của lipase. Ở nhiệt độ cao hơn, lipase được cố định và liên kết chéo trên bề mặt kỵ nước cho thấy độ ổn định nhiệt tối đa. Nhiệt độ tối ưu cho lipase cố định cao hơn 9 °C so với enzyme tự do, trong khi độ pH tối ưu vẫn giống nhau. Thời gian bán hủy của lipase hòa tan ở 50 °C được tính toán là 4.5 giờ, trong khi lipase cố định không mất hoạt tính ngay cả sau 8 giờ. Độ ổn định nhiệt độ (trong 1 giờ) của enzyme cố định đã được nâng cao từ 50 lên 60 °C so với enzyme chưa cố định. Các ứng dụng của lipase cố định trong quá trình este hóa cũng được trình bày.

Urease từ đậu rồng đã được cố định trong gel polyacrylamide với tỷ lệ cố định 50% tại 10% tổng monomer (chứa 5% chất liên kết chéo) với độ ổn định cơ học cao của gel. Khoảng 0,61 mg protein có thể được nạp vào mỗi 5 ml gel. Enzyme được cố định có t_1/2 khoảng 200 ngày khi được bảo quản trong đệm Tris/acetate 0,1 M, pH 6,5, ở 4 °C. Các dải gel đã được sử dụng 4×5 lần cho phép xét nghiệm ure trong thời gian 6 giờ với tổn thất hoạt động dưới 2%. Khoảng 50% sự cố định của urease trong calcium alginate được quan sát thấy ở nồng độ 3% alginate với 0,12 mg protein/ml alginate. Các hạt enzyme thu được cho thấy t_1/2 khoảng 75 ngày khi được bảo quản trong đệm Tris/acetate 0,1 M, pH 6,5, ở 4 °C. Các hạt đã được sử dụng 4–5 lần cho phép xét nghiệm ure trong thời gian 6 giờ với khoảng 40% tổn thất hoạt động. Trong cả hai trường hợp, hoạt tính enzyme tỷ lệ thuận với lượng enzyme được cố định. Hầu như không có sự rò rỉ của enzyme bị giữ qua một thời gian 48 giờ từ bất kỳ polymer nào. Cả hai chế phẩm enzyme được cố định đều được sử dụng để phân tích hàm lượng ure huyết trong một số mẫu lâm sàng từ bệnh viện đại học. Các kết quả thu được so sánh tích cực với các kết quả đạt được từ phương pháp thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm bệnh lý lâm sàng.

Urate oxidase được sử dụng ở người để kiểm soát axit uric ở bệnh nhân nhận hóa trị. Rasburicase (Fasturtec®/Elitek®), một loại urate oxidase tái tổ hợp được biểu hiện trong Saccharomyces cerevisiae, đã được so sánh với Uricozyme®, enzyme tự nhiên được sản xuất bởi Aspergillus flavus. Rasburicase có độ tinh khiết cao hơn, được chứng minh qua phân tích SDS/PAGE và sắc ký, và hoạt tính đặc hiệu tốt hơn. Những khác biệt quan sát được đối với Uricozyme® có thể là do quá trình tinh chế trước đó, điều này làm biến đổi enzyme. Ngược lại, quá trình sản xuất rasburicase giữ gìn cấu trúc của phân tử. Phân tích MS cho thấy Uricozyme® chứa một adduct cysteine tại Cys¹⁰³. Trong cấu trúc tinh thể, nguyên tử lưu huỳnh của residu cysteine tại vị trí 103 được định hướng về bề mặt bên ngoài của tetramer, trong khi nguyên tử lưu huỳnh của hai residu cysteine khác (Cys³⁵ và Cys²⁹⁰) được định hướng về trung tâm của kênh hình thành bởi tetramer. Cùng một adduct được tạo ra bằng cách ủ đơn giản rasburicase với cysteine.

Rosmarinic acid (RosA) is a phenolic acid compound extracted from perilla. In this experiment, the Oxford cup method was used to verify the antibacterial activity of PerillaRosA against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, and Bacillus subtilis. By polyacrylamide gel electrophoresis, the effect of RosA on bacterial nucleic acid and bacterial Na⁺/K⁺‐ATP‐ase activity, and scanning electron microscope to exploration of its antibacterial mechanism preliminarily. The results showed that RosA had antibacterial properties against all four bacteria. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of E. coli were 0.8 and 0.9 mg/ml, respectively. The MIC and MBC of Salmonella were 0.9 and 1.0 mg/ml, respectively. The MIC and MBC of S. aureus and B. subtilis were both 1.0 and 1.1 mg/ml. RosA has the bacteriostasis function, which can destroy bacterial cells and cell proteins and inhibit the activity of Na⁺/K⁺‐ATP‐ase in cells.

Troponin I (TnI) là tiểu đơn vị ức chế của phức hợp troponin và là dấu hiệu sinh hóa đặc hiệu cho nhồi máu cơ tim (MI). Nó được giải phóng vào dòng máu trong vòng 4–6 giờ sau khi xảy ra MI, đạt đỉnh sau 18–24 giờ và duy trì nồng độ cao trong tối đa 7 ngày. Trong công trình này, tôi đã xác định các dạng TnI có mặt trong huyết thanh của bệnh nhân MI. Bằng cách cố định các kháng thể anti‐TnI nhận diện các vị trí epitope khác nhau trên phân tử TnI, chúng tôi đã có thể tách TnI từ các mẫu huyết thanh của bệnh nhân MI. Phân tích Western-blot sau SDS/PAGE cho thấy hai mảnh TnI chính với khối lượng phân tử hiển thị lần lượt là 18000 và 14000 Da. Một trong hai hoặc cả hai mảnh đều được quan sát trong huyết thanh của những người bị MI. Các mảnh này được hình thành do quá trình phân hủy proteolytic từ vùng C-ở tận cùng của TnI. Quá trình xử lý một phần từ N-ở tận cùng của TnI cũng được phát hiện và liên quan đến sự hình thành của mảnh 14000 Da. Rất ít TnI nguyên vẹn chưa xử lý được phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhân sau MI. Quá trình phân hủy in vitro của TnI tim đã được nghiên cứu bằng cách ủ TnI tái tổ hợp từ bò hoặc người trong huyết thanh. Các phân tích Western-blot với kháng thể TnI cho thấy rằng TnI tinh khiết được thêm vào huyết thanh người bình thường hoặc huyết thanh bệnh nhân MI đã được loại bỏ TnI phân hủy nhanh chóng thành các mảnh có khối lượng phân tử thấp hơn. Sự phân hủy của TnI có liên quan đến việc mất hoạt tính miễn dịch. TnI trong huyết thanh bị tách ra bởi kháng thể anti-TnI, trong điều kiện không tách rời, có liên quan đến ít nhất là troponin C (TnC) và troponin T (TnT). Phức hợp này được liên kết bởi các kháng thể anti-TnI, anti-TnC và anti-TnT.

Việc immobil hóa các protein thường dẫn đến sự định hướng ngẫu nhiên của các phân tử trên bề mặt của vật liệu mang, do đó việc giải thích cơ chế của những thay đổi trong các tính chất, chẳng hạn như độ ổn định nhiệt, trở nên rất khó khăn. Gần đây, chúng tôi đã chuẩn bị một số enzyme đột biến của protease trung tính giống thermolysin từ Bacillus stearothermophilus, chứa các residu cysteine ở những vị trí khác nhau trên bề mặt của phân tử protein. Những enzyme này cho phép immobil hóa tại vị trí cụ thể đến Activated Thiol‐Sepharose và cho thấy rằng các hiệu ứng ổn định rất phụ thuộc vào vị trí gắn kết [Mansfeld, Vriend, Van den Burg, Eijsink và Ulbrich‐Hofmann (1999) Biochemistry 38, 8240–8245]. Sự ổn định lớn nhất được đạt được sau khi immobil hóa các enzyme đột biến S65C và T56C/S65C trong khu vực cấu trúc (các vị trí 56–69) nơi mà quá trình mở ra bắt đầu. Trong nghiên cứu này, động học bất hoạt nhiệt của hai enzyme đột biến này, cũng như của enzyme pseudo‐wild‐type và thermolysin, đã được so sánh cho các loại hình thức immobil hóa khác nhau. Bên cạnh việc immobil hóa tại vị trí cụ thể thông qua các nhóm thiol, các enzyme cũng được gắn kết ngẫu nhiên thông qua các nhóm amino của chúng hoặc bằng liên kết loại hỗn hợp. Ma trận cơ bản là Sepharose 4B trong tất cả các vật mang. Trong khi các enzyme gắn kết tại vị trí cụ thể với Activated Thiol‐Sepharose cho thấy động học bất hoạt bậc nhất rõ ràng như các enzyme tan, các chế phẩm enzyme được immobil hóa khác được đặc trưng bởi động học bất hoạt biphasic rõ ràng phản ánh sự không đồng nhất của các phân tử enzyme trên vật mang với respect đến quá trình mở ra nhiệt. Việc gắn kết tại vị trí cụ thể dẫn đến sự ổn định mạnh mẽ hơn so với loại gắn kết hỗn hợp. Tuy nhiên, việc immobil hóa vào một vật mang được chức năng hóa cao qua các nhóm amino đã tăng cường thêm sự ổn định, gợi ý rằng việc gắn kết nhiều ngoài khu vực mở ra 56–65 có thể tăng cường thêm sự ổn định của các phân tử enzyme.

Enzyme lipase đang được sử dụng ngày càng nhiều trong việc tổng hợp các trung gian thuốc và các phân tử quan trọng về dược lý cũng như trong việc phân giải các hỗn hợp racemic để thu nhận các enantiomer có hoạt tính sinh học. Alginate đã được sử dụng như một liên kết macroaffinity để tinh chế lipase từ Chromobacterium viscosum, tuyến tụy lợn và hạt lúa mì thông qua kỹ thuật lắng đọng liên kết. Trong tất cả các trường hợp, chế phẩm tinh khiết thể hiện một dải duy nhất trên SDS/PAGE. Quá trình này mang lại năng suất đầy đủ lần lượt là 87%, 75% và 62% cho lipase từ Chromobacterium, lợn và hạt lúa mì. Alginate cũng được tìm thấy là chất kích hoạt các enzyme; hiệu ứng này gây ấn tượng nhất trong trường hợp lipase hạt lúa mì, nơi mà sự tăng cường hoạt động được quan sát thấy lên tới 4-5 lần. Hơn nữa, alginate cũng bảo vệ enzyme khỏi sự bất hoạt do nhiệt độ.