Crispr là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa CRISPR

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) là một hệ thống bảo vệ di truyền của vi khuẩn và vi khuống, được cấu thành từ các đoạn trình tự lặp ngắn xen kẽ với các spacer chứa thông tin di truyền của virus từng xâm nhập. Hệ CRISPR kết hợp với các protein Cas (CRISPR-associated) tạo thành bộ máy nhận diện và cắt phá ADN ngoại lai, nhờ đó ngăn ngừa sự lây nhiễm tiếp theo của mầm bệnh.

Trong ứng dụng công nghệ sinh học, CRISPR được lập trình dưới dạng RNA dẫn đường (gRNA), cùng với nuclease Cas9 hoặc các biến thể khác, để xác định và chỉnh sửa vị trí cụ thể trên ADN của sinh vật nhân chuẩn. Sự linh hoạt và hiệu suất cao của CRISPR/Cas đã làm thay đổi căn bản cách thức nghiên cứu gen và phát triển liệu pháp gen.

Tham khảo: NCBI PMC – CRISPR Overview

Cấu trúc và thành phần của hệ CRISPR/Cas

Một locus CRISPR điển hình bao gồm chuỗi repeat ngắn (20–50 nucleotide) xen kẽ spacer, spacer chính là bản sao của một đoạn ADN xâm nhập trước đó. Repeat tạo thành cấu trúc stem–loop giúp tương tác với RNA phiên mã, trong khi spacer cung cấp tính đặc hiệu cho hướng dẫn RNA.

Các protein Cas được mã hóa gần locus CRISPR, trong đó Cas9 là nuclease cắt đứt hai mạch ADN. Ngoài Cas9, còn có Cas12 (cắt mạch đơn và hai mạch) và Cas13 (cắt ARN). Đối với CRISPR/Cas9, RNA dẫn đường gồm tracrRNA và crRNA được hợp nhất thành single-guide RNA (sgRNA), giúp đơn giản hóa thiết kế và ứng dụng.

Bảng tóm tắt thành phần chính:

Thành phần	Chức năng
Repeat	Tạo cấu trúc stem–loop liên kết tracrRNA
Spacer	Chứa trình tự mục tiêu của virus/ADN ngoại lai
Cas9	Nuclease cắt đứt hai mạch ADN tại vị trí gRNA chỉ định
sgRNA	Kết hợp crRNA và tracrRNA, dẫn đường Cas9 đến locus mục tiêu

Tham khảo cấu trúc: Nature Reviews Genetics – CRISPR/Cas9 Structure

Cơ chế hoạt động

CRISPR/Cas hoạt động qua ba giai đoạn chính: thích nghi, sao chép và tấn công. Trong giai đoạn thích nghi, hệ protein Cas thu nhận đoạn ADN ngoại lai và lồng vào mảng CRISPR dưới dạng spacer mới. Khi giải gen, locus CRISPR được phiên mã thành pre-crRNA, sau đó xử lý thành crRNA độc lập.

Giai đoạn tấn công bắt đầu khi crRNA hoặc sgRNA dẫn Cas nuclease đến trình tự mục tiêu, đồng thời nhận diện motif PAM (Protospacer Adjacent Motif) kề ngay vị trí cần cắt. Cas9 tạo vết cắt hai mạch tại vị trí này, kích hoạt cơ chế sửa chữa ADN nội sinh của tế bào.

Có hai con đường sửa chữa chính:

• NHEJ (Non‑Homologous End Joining): nối trực tiếp hai đầu đứt, dễ phát sinh chèn/lược nucleotide.
• HDR (Homology-Directed Repair): sử dụng khuôn DNA bổ sung để tái tạo trình tự chính xác.

Tỷ lệ chọn NHEJ/HDR phụ thuộc vào giai đoạn chu kỳ tế bào và điều kiện thí nghiệm. HDR cho phép chỉnh sửa theo ý muốn như chèn gene mới, trong khi NHEJ thích hợp cho tạo đột biến ngắt khung đọc.

Nguồn chi tiết: NIH – CRISPR-Cas9 Overview

Lịch sử phát triển của CRISPR/Cas9

Năm 2002, chuỗi CRISPR đầu tiên được mô tả trong Escherichia coli như một dấu ấn di truyền chưa rõ chức năng. Đến 2007, Barrangou và đồng nghiệp chứng minh CRISPR là hệ thống miễn dịch vi khuẩn khi spacer mới xuất hiện sau thách nhiễm virus.

Năm 2012, Jennifer Doudna và Emmanuelle Charpentier báo cáo thành công việc tái lập hệ CRISPR/Cas9 ngoài tế bào, cho phép cắt ADN theo lập trình bằng RNA dẫn đường. Bài báo xuất bản trên Science đánh dấu bước ngoặt cho công nghệ chỉnh sửa gen.

Từ 2013 đến 2015, CRISPR/Cas9 được ứng dụng rộng rãi trong tế bào nhân chuẩn, động vật và thực vật. Nhiều biến thể nuclease và kỹ thuật cải tiến (base editing, prime editing) lần lượt ra đời, mở rộng phạm vi ứng dụng và giảm thiểu off‑target.

Xem chi tiết timeline: Broad Institute – CRISPR Timeline

Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản

CRISPR/Cas9 cho phép tạo đột biến knockout và knockin với độ chính xác cao, giúp làm sáng tỏ chức năng của gen trong sinh vật nhân chuẩn. Việc sử dụng thư viện gRNA tổng hợp hàng nghìn trình tự khác nhau kết hợp với CRISPR screening giúp xác định các gene thiết yếu cho sinh trưởng, phát triển và đáp ứng với stress tế bào.

High‑throughput screening qua CRISPR library thực hiện như sau: tế bào được biến đổi đồng loạt bởi bộ gRNA đa dạng, sau đó áp dụng áp lực chọn lọc (ví dụ: thuốc hóa trị), và cuối cùng giải trình tự vùng gRNA để tìm gene liên quan đến khả năng sống sót. Kết quả phân tích cho phép xác định yếu tố điều hòa sinh học mới, phục vụ cho nghiên cứu ung thư, miễn dịch và sinh học mô hình.

CRISPRi và CRISPRa (interference/activation) dùng biến thể dCas9 gắn domain ức chế hoặc kích hoạt phiên mã, điều chỉnh biểu hiện gen mà không làm đứt gãy ADN. Phương pháp này thuận tiện cho nghiên cứu quy định điều hòa gen và mạng lưới tín hiệu trong tế bào.

Ứng dụng trong y học

Liệu pháp chỉnh sửa gen somatic sử dụng CRISPR/Cas9 đang được nghiên cứu nhằm điều trị nhiều bệnh di truyền như thiếu máu hồng cầu hình liềm, beta-thalassemia, cystic fibrosis. Quá trình điều trị bao gồm lấy tế bào gốc tạo máu của bệnh nhân, chỉnh sửa locus đột biến ex vivo, sau đó truyền ngược trở lại cơ thể.

Trong ung thư, CRISPR được ứng dụng để tối ưu hóa tế bào CAR‑T: gRNA hướng đến gene PD-1 trong tế bào T, loại bỏ cơ chế ức chế miễn dịch của khối u, đồng thời chèn kháng thể đơn dòng chống kháng nguyên CD19 để tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ác tính. Các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I/II ghi nhận đáp ứng khách quan cao và tỷ lệ giảm tái phát đáng kể.

• Sửa locus HBB để khôi phục cấu trúc β-globin bình thường
• Ức chế PCSK9 trong gan để giảm cholesterol máu
• Chỉnh sửa gene CEP290 nhằm điều trị loạn dưỡng võng mạc

Ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp sinh học

CRISPR/Cas giúp tạo giống cây trồng có tính trạng mong muốn mà không cần chèn gene ngoại lai, ví dụ lúa chịu mặn nhờ bất hoạt gene OsRR22, đậu tương tăng hàm lượng dầu nhờ chỉnh sửa gene liên quan quá trình tổng hợp axit béo. Phương pháp này giảm thời gian chọn tạo giống từ nhiều năm xuống chỉ còn vài tháng.

Trong công nghiệp sinh học, vi sinh vật như Escherichia coli và Saccharomyces cerevisiae được tối ưu hóa đường trao đổi chất bằng cách chỉnh sửa đồng thời nhiều gene, nâng cao sản lượng ethanol, axit lactic, kháng sinh và enzyme công nghiệp. Việc sử dụng CRISPR multiplexing với nhiều gRNA trong một lần chuyển nạp giúp tăng hiệu quả chỉnh sửa đa mục tiêu.

Đối tượng	Tính trạng chỉnh sửa	Kết quả
Lúa (Oryza sativa)	Chịu mặn	Giảm thẩm thấu muối, tăng năng suất 20%
Yeast (S. cerevisiae)	Tăng chịu ethanol	Tăng sản lượng lên 35%
Đậu nành	Tăng hàm lượng dầu	Mức độ axit béo bão hòa giảm 15%

Biến thể và cải tiến thế hệ mới

Base editing cho phép chuyển đổi trực tiếp C→T hoặc A→G mà không tạo vết cắt hai mạch, giảm thiểu off‑target và mảng mosaic. Công nghệ này dựa trên fusion protein giữa Cas9 nickase và deaminase, hoạt động hiệu quả ở nhiều loại tế bào.

Prime editing kết hợp Cas9 nickase với reverse transcriptase, sử dụng pegRNA (prime editing guide RNA) chứa cả trình tự mục tiêu và mẫu chỉnh sửa. Prime editing có thể thực hiện các thao tác chèn, xóa hoặc thay thế nucleotide với độ chính xác cao, mở rộng khả năng chỉnh sửa so với base editing và CRISPR/Cas9 tiêu chuẩn.

Cas12 và Cas13 mở rộng ứng dụng sang cắt ARN và single‑stranded DNA; Cas12a (Cpf1) có PAM khác so với Cas9, giúp đa dạng hóa locus mục tiêu. Các hệ thống collateral cleavage của Cas12/Cas13 còn được phát triển thành công cụ chẩn đoán phân tử nhạy cao (SHERLOCK, DETECTR).

An toàn, rủi ro và biện pháp giảm thiểu

Sai vị trí ngoài mục tiêu (off‑target) có thể phát sinh đột biến bất lợi. Cần kết hợp sử dụng biến thể high‑fidelity Cas, tối ưu hóa gRNA qua thuật toán dự đoán và kiểm tra in vitro trước khi ứng dụng in vivo.

Giám sát an toàn bao gồm giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) hoặc exome (WES) trước và sau chỉnh sửa, đánh giá biến dị bất thường. Xét nghiệm độc tính, khả năng sinh ung thư và mô hình động vật là bước bắt buộc trước thử nghiệm lâm sàng.

• Thiết kế gRNA với tài nguyên MIT CRISPR Design Tool
• Dùng RNP Cas9–gRNA để giảm thời gian tồn tại enzyme trong tế bào
• Áp dụng double‑nickase strategy để tăng tính đặc hiệu

Vấn đề đạo đức và khung pháp lý

Chỉnh sửa gen dòng mầm (germline) vĩnh viễn truyền cho thế hệ sau, dấy lên lo ngại về an toàn và bất bình đẳng xã hội. Nhiều quốc gia cấm hoặc kiểm soát nghiêm ngặt: FDA (Mỹ) yêu cầu đánh giá IND, EMA (EU) xếp loại GMO, trong khi UNESCO kêu gọi quy chuẩn đạo đức toàn cầu.

Đối với chỉnh sửa somatic, khung pháp lý cho phép thử nghiệm lâm sàng có giám sát chặt chẽ, yêu cầu đồng thuận thông tin của bệnh nhân và đánh giá lợi ích–rủi ro. Các nguyên tắc “không làm hại” (do no harm), “công bằng tiếp cận” và “minh bạch” được đặt lên hàng đầu.

Tài liệu tham khảo

1. Jinek, M., et al. (2012). “A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.” Science, 337(6096), 816–821.
2. Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2014). “The New Frontier of Genome Engineering with CRISPR-Cas9.” Science, 346(6213), 1258096.
3. Hsu, P. D., et al. (2013). “DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.” Nat. Biotechnol., 31(9), 827–832.
4. Komor, A. C., et al. (2016). “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.” Nature, 533(7603), 420–424.
5. Anzalone, A. V., et al. (2019). “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.” Nature, 576(7785), 149–157.
6. Chen, J. S., & Doudna, J. A. (2017). “The chemistry of Cas9 and its CRISPR colleagues.” Nat. Rev. Chem., 1(10), 0078.
7. Collaborative articles: FDA – Precision Medicine; WHO – Gene Editing Fact Sheet.