RNA

RNA vòng được cấu thành từ một chuỗi exon đã được mô tả ở một số lượng nhỏ các gen. Được xem là kết quả của các sai sót trong quá trình cắt ghép, các loại RNA vòng chưa có chức năng đã được biết đến. Để xác định vũ trụ các RNA vòng nội sinh, chúng tôi đã thực hiện giải trình tự RNA quy mô lớn (RNA-seq) từ các thư viện chuẩn bị từ RNA đã loại bỏ ribosome có hoặc không có sự tiêu hóa bởi exonuclease RNA, RNase R. Chúng tôi đã xác định được hơn 25.000 loại RNA khác nhau trong nguyên bào sợi người chứa các exon không đồng tuyến (được gọi là “backsplice”) và chúng đã được làm giàu một cách tái lập từ việc phân hủy RNA tuyến tính bằng exonuclease. Những RNA này đã được xác thực là RNA vòng (ecircRNA), thay vì RNA tuyến tính, và chúng ổn định hơn so với các mRNA tuyến tính liên quan trong cơ thể sống. Trong một số trường hợp, độ phong phú của các phân tử vòng vượt quá mRNA tuyến tính liên quan đến hơn 10 lần. Theo ước tính thận trọng, chúng tôi đã xác định được ecircRNA từ 14,4% số gen đang được phiên mã tích cực ở nguyên bào sợi người. Việc áp dụng phương pháp này cho RNA tinh hoàn chuột đã xác định được 69 ecircRNA tại các vị trí đồng nhất chính xác với RNA vòng của con người. Đáng chú ý, các kinase đồng loại HIPK2 và HIPK3 tạo ra nhiều ecircRNA từ exon thứ hai của chúng ở cả người và chuột. Mặc dù RNA vòng HIPK3 chứa một điểm bắt đầu dịch mã AUG, nó và các ecircRNA khác không gắn với ribosome. RNA vòng có thể bị phân hủy bởi siRNA và do đó, có thể đóng vai trò như các RNA nội sinh cạnh tranh. Phân tích tin sinh học đã tiết lộ các đặc điểm chung của các exon vòng, bao gồm các intron bao quanh dài chứa các đoạn lặp lại ALU bổ sung. Các dữ liệu này cho thấy ecircRNA phong phú, ổn định, bảo tồn và là sản phẩm không ngẫu nhiên của quá trình cắt ghép RNA, có thể tham gia vào việc kiểm soát sự biểu hiện gen.

MicroRNA (miRNA) là các sản phẩm gene RNA không mã hóa nhỏ, dài khoảng 22 nt, được xử lý bởi Dicer từ các precursors có cấu trúc thứ cấp hình kẹp tóc đặc trưng. Các hướng dẫn được trình bày để xác định và chú thích các miRNA mới từ các sinh vật đa dạng, đặc biệt để các miRNA có thể được phân biệt đáng tin cậy khỏi các RNA khác như RNA can thiệp nhỏ. Chúng tôi mô tả các tiêu chí cụ thể cho việc xác thực thực nghiệm các miRNA, và các quy ước trong việc đặt tên cho các miRNA và các gene miRNA. Cuối cùng, một trung tâm trực tuyến để phân bổ tên gene miRNA được cung cấp bởi cơ sở dữ liệu Rfam của các họ RNA.

Các yếu tố điều chỉnh sự biểu hiện của các microRNA (miRNAs), một gia đình RNA điều tiết không mã hóa phổ biến dài ~22-nt, vẫn chưa được xác định. Tuy nhiên, hiện đã biết rằng miRNAs được sao chép đầu tiên dưới dạng tiền chất chủ yếu không có cấu trúc, được gọi là miRNA nguyên thủy (pri-miRNA), và sau đó được xử lý theo trình tự trong nhân, để tạo ra sản phẩm trung gian pre-miRNA dạng chóp ~65-nt, và sau đó trong tế bào chất, để tạo ra miRNA trưởng thành. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm cách xác định polymerase RNA chịu trách nhiệm cho sự sao chép miRNA và xác định cấu trúc của một miRNA người dài đầy đủ. Chúng tôi đã chỉ ra rằng các tiền chất pri-miRNA cho chín miRNAs của con người đều được chóp và polyadenyl hóa, và báo cáo trình tự của RNA pri-miR-21 dài đầy đủ, dài ~3433-nt. Trình tự gen pri-miR-21 này được bao quanh ở đầu 5′ bởi một yếu tố tăng cường có khả năng sao chép các mRNA không đồng nhất và ở đầu 3′ bởi một trình tự polyadenyl hóa đồng thuận. Việc xử lý hạt nhân của các pri-miRNA đã được phát hiện là hiệu quả, do đó chủ yếu ngăn cản việc xuất khẩu các pri-miRNA nguyên thủy dài đầy đủ ra ngoài nhân. Tuy nhiên, một tiền chất miRNA có gốc chủ thể intact nằm trong 3′ UTR của một gene mã hóa protein chỉ làm giảm một phần sự biểu hiện của khung đọc mở liên kết, có thể là do mRNA rút ngắn 3′ vẫn có thể được xuất khẩu và biểu hiện. Tổng thể, những dữ liệu này cho thấy rằng các pri-miRNA ở người không chỉ tương đồng về cấu trúc với các mRNA mà còn có thể, thực tế, hoạt động như cả pri-miRNAs và mRNAs.

Các phương pháp gen toàn bộ đã chứng tỏ hữu ích trong việc khảo sát các con đường sinh học quan trọng ở những sinh vật mô hình như Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, và Caenorhabditis elegans, nhưng các kỹ thuật tương tự đã gặp khó khăn khi áp dụng vào hệ thống động vật có vú. Mặc dù việc điều chỉnh bộ gen ở chuột đã dẫn đến việc xác định các gen và chức năng của chúng, phương pháp này tốn kém, mất nhiều thời gian và thường dẫn đến các kiểu hình chết người. Can thiệp RNA (RNAi) là một quá trình bảo tồn tiến hóa của việc tắt gen đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để điều tra chức năng gen thông qua di truyền học đảo ngược. Ở đây, chúng tôi mô tả việc vận chuyển các cassette biểu hiện RNA hình chóp nhắm tới protein huỳnh quang xanh (GFP) bằng cách sử dụng các vector retrovirus dựa trên virus bạch cầu Moloney và lentivirus. Cả hai dòng tế bào biến đổi và tế bào dendritic nguyên phát, thường bị kháng với việc chuyển gen dựa trên chuyển nạp, đã thể hiện sự ức chế ổn định các gen mục tiêu, bao gồm gen ức chế khối u TP53 trong các tế bào sợi người bình thường. Báo cáo này chứng minh rằng cả việc biểu hiện RNAi trung gian bởi virus bạch cầu Moloney và vector lentivirus có thể đạt được sự ức chế gen hiệu quả, ổn định trong nhiều hệ thống sinh học khác nhau và sẽ hỗ trợ trong việc làm sáng tỏ chức năng gen trong nhiều loại tế bào bao gồm cả tế bào gốc.

Các microRNA (miRNA) là các RNA nội sinh ngắn được biết đến với khả năng ức chế biểu hiện gen sau phiên mã ở động vật và thực vật. Một khảo sát lập bản đồ gen vi sợi cho thấy các mẫu biểu hiện của 175 miRNA ở người trên 24 cơ quan khác nhau của con người. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các cặp miRNA gần nhau thường được biểu hiện đồng thời. Ngoài ra, một sự chuyển tiếp đột ngột trong mối tương quan giữa các cặp miRNA được biểu hiện xảy ra ở khoảng cách 50 kb, ngụ ý rằng các miRNA cách nhau <50 kb thường có nguồn gốc từ một phiên mã chung. Một số microRNA nằm trong các intron của các gen chủ. Các miRNA nằm trong intron thường được biểu hiện đồng thời với mRNA của gen chủ, ngụ ý rằng chúng cũng thường có nguồn gốc từ một phiên mã chung và rằng các phân tích tại chỗ về biểu hiện của gen chủ có thể được sử dụng để khảo sát vị trí không gian và thời gian của các miRNA nằm trong intron.

Hiện nay, đã rõ rằng có một sự đa dạng của các RNA vòng trong các hệ thống sinh học. RNA vòng có thể được sản xuất bằng việc nối trực tiếp các đầu 5′ và 3′ của RNA thẳng, như những trung gian trong các phản ứng xử lý RNA, hoặc thông qua quá trình "gập nối ngược", trong đó một vị trí nối 5′ ở phía hạ lưu (người hiến nối) được kết hợp với một vị trí nối 3′ ở phía thượng lưu (người chấp nhận nối). RNA vòng có những tính chất độc đáo bao gồm tiềm năng cho quá trình khuếch đại vòng RNA, khả năng sắp xếp lại thứ tự của thông tin di truyền, bảo vệ khỏi các exonuclease, và hạn chế trong việc gập RNA. RNA vòng có thể hoạt động như các khuôn mẫu cho sự sao chép của viroid và virus, như những trung gian trong các phản ứng xử lý RNA, như các chất điều tiết phiên mã trong cis, như snoRNA, và như các miRNA hấp thụ. Ở đây, chúng tôi xem xét sự đa dạng của RNA vòng, sự hình thành và chuyển hóa của chúng, và các chức năng đã biết và dự đoán của chúng.

Gần đây, hàng trăm microRNA (miRNA) đã được nhân bản từ nhiều loại sinh vật khác nhau trên toàn bộ hệ sinh thái. Mặc dù miRNA có mức độ bảo tồn cao, chức năng của chúng nói chung, và đặc biệt là ở động vật có vú, vẫn chỉ mới bắt đầu được xác định. Ở đây, chúng tôi cho thấy rằng một mảng DNA oligonucleotide có thể được sử dụng thành công để phân tích song song các hồ sơ biểu hiện miRNA từ mô hoặc tế bào. Từ một tập hợp con các miRNA thể hiện trong não, chúng tôi đã thiết kế một mảng oligonucleotide với các mồi đặc hiệu cho 44 miRNA trưởng thành. Những mảng này cho thấy sự điều chỉnh chính xác của biểu hiện miRNA trong các giai đoạn phát triển não của động vật có vú. Khoảng 20% số miRNA đã được kiểm tra có sự thay đổi đáng kể trong biểu hiện trong quá trình phát triển não bình thường, và hai trong số đó, miR-9 và miR-131, đã bị điều chỉnh bất thường ở chuột thiếu presenilin-1, những con chuột này có những khiếm khuyết nghiêm trọng trong phát triển não. Các bản sao có mẫu biểu hiện được điều chỉnh trên mảng đã được xác nhận bằng các bản Northern blot. Thêm vào đó, một phân tích sinh tin học của các miRNA được điều chỉnh theo phát triển đã gợi ý các mục tiêu mRNA tiềm năng. Các mảng cũng tiết lộ miRNA phân bố đến các polyribosome đang dịch mã trong các neuron nguyên phát, nơi chúng có thể điều chỉnh quá trình dịch mã. Do đó, các mảng oligonucleotide cung cấp một công cụ mới để nghiên cứu biểu hiện miRNA trong một loạt các bối cảnh sinh học và bệnh lý. Việc tạo ra các cụm của các miRNA đồng biểu hiện sẽ góp phần vào việc hiểu rõ hơn về sự điều chỉnh, chức năng của chúng, và phát hiện các mục tiêu mRNA.

Phương pháp "bã miRNA" đã được giới thiệu ba năm trước như một cách để tạo ra sự mất chức năng miRNA liên tục trong các dòng tế bào và các sinh vật chuyển gen. RNA bã chứa các vị trí gắn kết bổ sung với miRNA mà chúng ta quan tâm, và được sản xuất từ các gen chuyển trong các tế bào. Cũng giống như hầu hết các gen mục tiêu miRNA, các vị trí gắn kết của một bã rất đặc hiệu với vùng hạt giống của miRNA, cho phép chúng chặn lại cả một gia đình miRNA liên quan. Cách tiếp cận chuyển gen này đã chứng tỏ là một công cụ hữu ích để khám phá chức năng của miRNA trong nhiều hệ thống thí nghiệm khác nhau. Tại đây, chúng tôi sẽ thảo luận về những cách mà các bã và các cấu trúc liên quan có thể được tối ưu hóa và xem xét những ứng dụng gần đây của phương pháp này, với sự nhấn mạnh đặc biệt vào sự biểu hiện ổn định trong các nghiên cứu ung thư và trong các động vật chuyển gen.

Các microRNA là những yếu tố điều tiết đặc hiệu theo trình tự cho sự biểu hiện gen hậu phiên mã trong nhiều eukaryote. Chúng được cho là điều khiển sự biểu hiện của hàng ngàn mRNA mục tiêu, với mỗi mRNA được cho là bị tác động bởi nhiều microRNA. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra nhiều cơ chế mà microRNA hạ thấp mức biểu hiện của các mRNA mục tiêu và liên kết một cấu trúc tế bào con nổi tiếng, các thể xử lý tế bào chất (PBs) với con đường microRNA. Phát hiện rằng các microRNA bị biểu hiện sai trong các loại ung thư đã củng cố ý tưởng rằng vai trò điều tiết của chúng là rất quan trọng.