RNA

Các ứng dụng tiềm năng cho RNA chức năng đang nhanh chóng mở rộng, không chỉ nhằm mục đích đáp ứng các chức năng dựa trên chuỗi nucleotide chính mà còn thông qua aptamer RNA, có khả năng ức chế hoạt động của bất kỳ phân tử mục tiêu nào. Aptamer là những phân tử DNA hoặc RNA ngắn gập lại có thể được chọn lọc in vitro dựa trên ái lực cao của chúng đối với một phân tử mục tiêu. Ở đây, chúng tôi chứng minh khả năng của aptamer RNA nhận ra - và gắn với - IgG của người với độ đặc hiệu và ái lực cao. Một aptamer tối ưu với 23 nucleotide, Apt8-2, đã được chuẩn bị và cho thấy gắn với miền Fc của IgG người nhưng không gắn với các IgG khác, với ái lực cao. Apt8-2 được quan sát thấy cạnh tranh với protein A, nhưng không cạnh tranh với thụ thể Fcγ, để gắn với IgG. Phân tích độ dịch hóa lý NMR đã xác định được các vị trí gắn aptamer trên tiểu miền Fc, mà một phần chồng lấp với vị trí gắn protein A nhưng không phải với vị trí gắn thụ thể Fcγ. Cấu trúc bậc ba của các vị trí nhận diện được dự đoán trên miền Fc khác biệt đáng kể giữa IgG người và các loài IgG khác; điều này một phần giải thích cho tính đặc hiệu cao của aptamer đã chọn. Apt8-2 do đó có thể được sử dụng như một sự thay thế cho protein A trong việc tinh chế IgG người và kháng thể điều trị. Việc sử dụng Apt8-2 sẽ có một số lợi thế tiềm năng, mở ra khả năng phát triển các ứng dụng mới dựa trên thiết kế aptamer.

Chúng tôi đã xác định cấu trúc của một aptamer RNA (F5), chứa 2′-deoxy-2-aminopurine (2AP) tại vị trí −10, kết hợp với protein vỏ MS2 bằng cách ngâm RNA vào các hạt MS2 đã được tinh thể hóa trước. Vị trí −10 của RNA là một yếu tố quan trọng quyết định ái lực liên kết với protein vỏ. Adenine tại vị trí này trong các cấu trúc RNA stem-loop khác tạo ra ba liên kết hydro với các nhóm chức năng của protein. Việc thay thế 2AP cho adenine tại vị trí −10 trong aptamer F5 tạo ra một RNA có ái lực cao nhất được báo cáo cho đến nay đối với protein vỏ. Cấu trúc X-ray đã tinh chỉnh cho thấy cơ sở 2AP tạo ra một liên kết hydro bổ sung với protein so với adenine, điều này có thể là nguồn gốc chính của sự gia tăng ái lực. Cũng có một số thay đổi nhỏ trong vị trí của xương phosphate so với F5 chưa được chỉnh sửa, điều này cũng có thể góp phần vào ái lực. Những chuyển động phosphate như vậy là phổ biến trong cấu trúc của các RNA gắn với vỏ protein MS2 T = 3 và nêu bật những vấn đề trong việc thiết kế mới các ligand liên kết RNA.

Aptamer, một lớp liệu pháp mới nổi, là các phân tử DNA hoặc RNA được chọn để liên kết với các mục tiêu phân tử, trải dài từ các hợp chất hữu cơ nhỏ đến các protein lớn. Tất cả các cấu trúc đã được xác định của aptamer trong phức hợp với các mục tiêu phân tử nhỏ cho thấy aptamer bao bọc các ligand như vậy. Trong các cấu trúc của aptamer trong phức hợp với protein tự nhiên liên kết với axit nucleic, aptamer chiếm vị trí liên kết với axit nucleic và thường mô phỏng các tương tác tự nhiên. Ở đây, chúng tôi trình bày một cấu trúc tinh thể của một aptamer RNA liên kết với thrombin người, một protein không tự nhiên liên kết với axit nucleic, với độ phân giải 1.9 Å. Aptamer, bám vào thrombin tại vị trí liên kết cho heparin, trình bày một bề mặt phân tử mở rộng tương thích với protein. Nhận diện protein liên quan đến việc chồng chất các gốc adenine đơn ở lõi của cấu trúc thứ cấp với các chuỗi bên arginine. Những kết quả này cho thấy cách mà aptamer RNA có thể gập lại thành những cấu hình phức tạp cho phép chúng tương tác chặt chẽ với các bề mặt mở rộng trên các protein không liên kết với RNA.

Protein Argonaute (Ago) là các protein tác động của hiện tượng can thiệp RNA (RNAi) và các cơ chế kìm hãm liên quan được điều hòa bởi các RNA nhỏ. Các protein Ago liên kết trực tiếp với microRNA (miRNA) và với các RNA can thiệp ngắn, đồng thời là các thành phần protein lõi của các phức hợp kìm hãm RNA được tạo ra (RISCs) và microRNPs (miRNPs). Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo rằng một RNA khoảng 70 nucleotide liên kết cụ thể với Ago2 được tinh chế bằng miễn dịch và được biểu hiện trong tế bào 293 của người. Thông qua việc ghép nối theo hướng, chúng tôi đã xác định RNA này là tRNA^Met của ti thể (mt tRNA^Met). Nhiều tRNA (mt) khác nhau đã được phát hiện trong tế bào chất của tế bào 293, nhưng Ago2 chỉ được tìm thấy gắn kết có chọn lọc với (mt) tRNA^Met. Sự liên kết trong tế bào chất của (mt) tRNA^Met bị xuất khẩu với Ago2 phù hợp với các dữ liệu di truyền và vi thể liên kết ti thể với các thành phần và sự kiện liên quan đến RNAi.

Các sự kiện cắt ghép thay thế và cắt ghép nối trans chưa được nghiên cứu hệ thống trong tằm Bombyx mori. Ở đây, hệ gen của tằm đã được phân tích bằng RNA-seq. Chúng tôi đã xác định được 320 gen mới, chỉnh sửa 1140 mô hình gen, và phát hiện hàng ngàn sự kiện cắt ghép thay thế và 58 sự kiện cắt ghép nối trans. Nghiên cứu ba protein SR cho thấy cả mẫu cắt ghép thay thế và sản phẩm mRNA của chúng đều được bảo tồn từ côn trùng đến người, và một isoform của Srsf6 với intron được giữ lại được biểu hiện theo giới tính cụ thể trong bộ sinh dục tằm. Sự kiện cắt ghép nối mod(mdg4) ở tằm đã được xác nhận qua thực nghiệm. Chúng tôi đã xác định được các tích hợp từ một gen 5′ chung với 46 exon 3′ thay thế mới được xác định nằm trên cả hai sợi DNA trong một khu vực 500-kb. Các sự kiện cắt ghép nối trans khác ở B. mori đã được dự đoán qua phân tích tin sinh học, trong đó 12 sự kiện được xác nhận qua RT-PCR, sáu sự kiện được xác nhận thêm bằng SNP chimeric, và hai sự kiện được xác nhận qua RT-PCR đặc hiệu allele trong các tổ hợp F₁ từ các dòng tằm khác nhau của JS và L10, cho thấy rằng trans-splicing phổ biến hơn trong côn trùng so với những gì được nghĩ trước đây. Phân tích hệ gen của B. mori bằng RNA-seq cung cấp thông tin quý giá về các sự kiện cắt ghép thay thế điều hòa. Sự bảo tồn của các sự kiện cắt ghép qua các loài và các sự kiện cắt ghép nối trans mới được xác định gợi ý rằng B. mori là một mô hình tốt cho các nghiên cứu trong tương lai.

Các microRNA là những yếu tố điều tiết đặc hiệu theo trình tự cho sự biểu hiện gen hậu phiên mã trong nhiều eukaryote. Chúng được cho là điều khiển sự biểu hiện của hàng ngàn mRNA mục tiêu, với mỗi mRNA được cho là bị tác động bởi nhiều microRNA. Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra nhiều cơ chế mà microRNA hạ thấp mức biểu hiện của các mRNA mục tiêu và liên kết một cấu trúc tế bào con nổi tiếng, các thể xử lý tế bào chất (PBs) với con đường microRNA. Phát hiện rằng các microRNA bị biểu hiện sai trong các loại ung thư đã củng cố ý tưởng rằng vai trò điều tiết của chúng là rất quan trọng.

Phương pháp "bã miRNA" đã được giới thiệu ba năm trước như một cách để tạo ra sự mất chức năng miRNA liên tục trong các dòng tế bào và các sinh vật chuyển gen. RNA bã chứa các vị trí gắn kết bổ sung với miRNA mà chúng ta quan tâm, và được sản xuất từ các gen chuyển trong các tế bào. Cũng giống như hầu hết các gen mục tiêu miRNA, các vị trí gắn kết của một bã rất đặc hiệu với vùng hạt giống của miRNA, cho phép chúng chặn lại cả một gia đình miRNA liên quan. Cách tiếp cận chuyển gen này đã chứng tỏ là một công cụ hữu ích để khám phá chức năng của miRNA trong nhiều hệ thống thí nghiệm khác nhau. Tại đây, chúng tôi sẽ thảo luận về những cách mà các bã và các cấu trúc liên quan có thể được tối ưu hóa và xem xét những ứng dụng gần đây của phương pháp này, với sự nhấn mạnh đặc biệt vào sự biểu hiện ổn định trong các nghiên cứu ung thư và trong các động vật chuyển gen.

Gần đây, hàng trăm microRNA (miRNA) đã được nhân bản từ nhiều loại sinh vật khác nhau trên toàn bộ hệ sinh thái. Mặc dù miRNA có mức độ bảo tồn cao, chức năng của chúng nói chung, và đặc biệt là ở động vật có vú, vẫn chỉ mới bắt đầu được xác định. Ở đây, chúng tôi cho thấy rằng một mảng DNA oligonucleotide có thể được sử dụng thành công để phân tích song song các hồ sơ biểu hiện miRNA từ mô hoặc tế bào. Từ một tập hợp con các miRNA thể hiện trong não, chúng tôi đã thiết kế một mảng oligonucleotide với các mồi đặc hiệu cho 44 miRNA trưởng thành. Những mảng này cho thấy sự điều chỉnh chính xác của biểu hiện miRNA trong các giai đoạn phát triển não của động vật có vú. Khoảng 20% số miRNA đã được kiểm tra có sự thay đổi đáng kể trong biểu hiện trong quá trình phát triển não bình thường, và hai trong số đó, miR-9 và miR-131, đã bị điều chỉnh bất thường ở chuột thiếu presenilin-1, những con chuột này có những khiếm khuyết nghiêm trọng trong phát triển não. Các bản sao có mẫu biểu hiện được điều chỉnh trên mảng đã được xác nhận bằng các bản Northern blot. Thêm vào đó, một phân tích sinh tin học của các miRNA được điều chỉnh theo phát triển đã gợi ý các mục tiêu mRNA tiềm năng. Các mảng cũng tiết lộ miRNA phân bố đến các polyribosome đang dịch mã trong các neuron nguyên phát, nơi chúng có thể điều chỉnh quá trình dịch mã. Do đó, các mảng oligonucleotide cung cấp một công cụ mới để nghiên cứu biểu hiện miRNA trong một loạt các bối cảnh sinh học và bệnh lý. Việc tạo ra các cụm của các miRNA đồng biểu hiện sẽ góp phần vào việc hiểu rõ hơn về sự điều chỉnh, chức năng của chúng, và phát hiện các mục tiêu mRNA.

Hiện nay, đã rõ rằng có một sự đa dạng của các RNA vòng trong các hệ thống sinh học. RNA vòng có thể được sản xuất bằng việc nối trực tiếp các đầu 5′ và 3′ của RNA thẳng, như những trung gian trong các phản ứng xử lý RNA, hoặc thông qua quá trình "gập nối ngược", trong đó một vị trí nối 5′ ở phía hạ lưu (người hiến nối) được kết hợp với một vị trí nối 3′ ở phía thượng lưu (người chấp nhận nối). RNA vòng có những tính chất độc đáo bao gồm tiềm năng cho quá trình khuếch đại vòng RNA, khả năng sắp xếp lại thứ tự của thông tin di truyền, bảo vệ khỏi các exonuclease, và hạn chế trong việc gập RNA. RNA vòng có thể hoạt động như các khuôn mẫu cho sự sao chép của viroid và virus, như những trung gian trong các phản ứng xử lý RNA, như các chất điều tiết phiên mã trong cis, như snoRNA, và như các miRNA hấp thụ. Ở đây, chúng tôi xem xét sự đa dạng của RNA vòng, sự hình thành và chuyển hóa của chúng, và các chức năng đã biết và dự đoán của chúng.

Các microRNA (miRNA) là các RNA nội sinh ngắn được biết đến với khả năng ức chế biểu hiện gen sau phiên mã ở động vật và thực vật. Một khảo sát lập bản đồ gen vi sợi cho thấy các mẫu biểu hiện của 175 miRNA ở người trên 24 cơ quan khác nhau của con người. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng các cặp miRNA gần nhau thường được biểu hiện đồng thời. Ngoài ra, một sự chuyển tiếp đột ngột trong mối tương quan giữa các cặp miRNA được biểu hiện xảy ra ở khoảng cách 50 kb, ngụ ý rằng các miRNA cách nhau <50 kb thường có nguồn gốc từ một phiên mã chung. Một số microRNA nằm trong các intron của các gen chủ. Các miRNA nằm trong intron thường được biểu hiện đồng thời với mRNA của gen chủ, ngụ ý rằng chúng cũng thường có nguồn gốc từ một phiên mã chung và rằng các phân tích tại chỗ về biểu hiện của gen chủ có thể được sử dụng để khảo sát vị trí không gian và thời gian của các miRNA nằm trong intron.