Polymerase chain reaction (polymerase chain reaction) là (phản ứng chuỗi polymerase - PCR) là kỹ thuật sinh học phân tử mang tính đột phá cho phép khuếch đại hàng triệu đến hàng tỷ bản sao của một đoạn trình tự DNA mục tiêu xác định trong ống nghiệm (in vitro).
Nguyên lý chu trình nhiệt và thành phần phản ứng
Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được Kary Mullis phát minh vào năm 1983 (đoạt giải Nobel Hóa học năm 1993), tạo nên một cuộc cách mạng sâu sắc trong toàn bộ khoa học sự sống và y học phân tử. Phản ứng hoạt động dựa trên sự lặp lại liên tục của một chu trình nhiệt 3 bước cơ bản được kiểm soát chính xác bằng máy luân nhiệt (thermal cycler):
- Biến tính (Denaturation, 94°C - 98°C): Phá vỡ các liên kết hydro giữa các cặp base nitơ, tách chuỗi xoắn kép DNA khuôn thành hai chuỗi đơn độc lập.
- Bắt cặp mồi (Annealing, 50°C - 65°C): Cho phép hai đoạn oligonucleotide mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) lai ghép bổ sung đặc hiệu vào hai đầu của đoạn DNA mục tiêu.
- Kéo dài (Extension, 68°C - 72°C): Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (điển hình là Taq polymerase chiết xuất từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus) tổng hợp chuỗi bổ sung mới theo chiều từ 5' đến 3' bằng cách gắn các deoxynucleotide triphosphate (dNTP).
Về mặt lý thuyết, số lượng bản sao DNA () tăng theo hàm số mũ sau chu trình nhiệt theo phương trình:
Trong đó là số lượng phân tử DNA khuôn ban đầu và là hiệu suất khuếch đại (với phản ứng lý tưởng , sau 30 chu trình lượng DNA được nhân lên hơn 2^{30} pprox 10^9 lần).
Các biến thể kỹ thuật PCR hiện đại
Từ nền tảng PCR truyền thống, nhiều cải tiến kỹ thuật tinh vi đã ra đời phục vụ các mục tiêu phân tích chuyên sâu:
| Kỹ thuật PCR | Nguyên lý cải tiến kỹ thuật | Ưu thế và ứng dụng then chốt |
|---|---|---|
| RT-PCR (Phiên mã ngược) | Sử dụng enzyme Reverse Transcriptase chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR | Phát hiện các virus RNA (SARS-CoV-2, HIV, cúm) và định lượng biểu hiện gen |
| Real-time PCR (qPCR) | Đo cường độ huỳnh quang (SYBR Green hoặc mẫu dò TaqMan) sau mỗi chu trình | Định lượng chính xác số lượng bản sao ban đầu (chu kỳ ngưỡng Ct), không cần điện di |
| Multiplex PCR | Sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu trong một ống phản ứng duy nhất | Tầm soát đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh hô hấp, tiêu hóa trong một xét nghiệm |
| Digital PCR (dPCR / ddPCR) | Phân chia phản ứng thành hàng chục ngàn giọt vi giọt dầu-nước nano | Định lượng tuyệt đối không cần đường chuẩn, phát hiện đột biến hiếm tỷ lệ cực thấp |
Ứng dụng sâu rộng trong y sinh học và pháp y
Nhờ độ nhạy cực cao và độ đặc hiệu tuyệt đối, PCR là công cụ không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực khoa học:
- Chẩn đoán bệnh nhiễm trùng: Tiêu chuẩn vàng xác định sớm các vi sinh vật khó nuôi cấy (lao, viêm gan virus B/C, HPV, vi khuẩn lậu Chlamydia).
- Di truyền học y học & Ung bướu: Phát hiện các đột biến điểm, chuyển đoạn gen định hướng điều trị thuốc nhắm đích (đột biến EGFR trong ung thư phổi, BCR-ABL trong bạch cầu mạn dòng tủy).
- Khoa học pháp y & Nhận dạng: Khuếch đại các đoạn lặp ngắn liên tiếp (Short Tandem Repeats - STR) để giám định huyết thống và xác định dấu vết tội phạm từ lượng mẫu sinh học vi lượng.