Wiley

Các latrunculin là những hợp chất biển có cấu trúc mới được tách chiết từ bọt biển Biển Đỏ Latrunculia magnifica. In vivo, chúng làm thay đổi hình dạng tế bào, gây rối loạn tổ chức vi sợi, và ức chế các quá trình thụ tinh cùng phát triển sớm do vi sợi trung gian. In vitro, latrunculin A gần đây đã được phát hiện có ảnh hưởng đến sự polyme hóa của actin tinh khiết theo cách nhất quán với sự hình thành một phức hợp mol 1:1 với G-actin. Những tác động in vitro này cùng với những chỉ dẫn trước đó cho thấy latrunculin có hiệu lực mạnh mẽ hơn cytochalasin gợi ý có sự khác biệt trong cơ chế tác động in vivo của hai loại thuốc này. Để làm sáng tỏ những khác biệt này, chúng tôi đã so sánh các tác động ngắn hạn và dài hạn của latrunculin đối với hình dạng tế bào và tổ chức actin với tác động của cytochalasin D. Sự tiếp xúc của các tế bào fibroblast hamster NIL8 trong thời gian 1–3 giờ với latrunculin A, latrunculin B, và cytochalasin D gây ra những thay đổi về hình dạng tế bào và tổ chức actin phụ thuộc vào nồng độ. Tuy nhiên, các thay đổi do latrunculin gây ra lại khác biệt rõ rệt so với những thay đổi do cytochalasin D gây ra. Hơn nữa, trong khi các tác động ban đầu đã hiển hiện với cả latrunculin A và cytochalasin D ở nồng độ khoảng 0.03 μg/ml, latrunculin A đã gây ra sự tròn hoàn toàn của tất cả các tế bào ở nồng độ 0.2 μg/ml, trong khi với cytochalasin D, sự co lại tối đa đạt được ở nồng độ cao hơn 10–20 lần. Các tác động ngắn hạn của latrunculin B tương tự như latrunculin A mặc dù latrunculin B có hiệu lực yếu hơn một chút. Cả ba loại thuốc đều ức chế phân bào trong các tế bào được đồng bộ, nhưng các tác động dài hạn của chúng lại khác biệt rõ rệt. Các tế bào NIL8 được điều trị bằng latrunculin A duy trì trạng thái biến đổi của chúng trong một khoảng thời gian dài. Ngược lại, các tác động của cytochalasin D phát triển theo thời gian trong môi trường nuôi cấy, và những thay đổi do latrunculin B gây ra là tạm thời trong sự hiện diện liên tục của thuốc. Các tác động tạm thời này được tìm thấy là do sự vô hiệu hóa dần dần latrunculin B bởi huyết tương và được sử dụng để so sánh các mô hình phục hồi hình dạng tế bào và tổ chức actin ở hai dòng tế bào khác nhau. So sánh này cho thấy các tác động tạm thời của latrunculin B là hoàn toàn hồi phục đối với các tế bào NIL8 nhưng không phải đối với các tế bào neuroblastoma chuột N1E-115.

Hai kháng thể IgG₁, κ đơn dòng chống lại actin đã được thu nhận từ một kỹ thuật hợp nhất trong đó actin từ dạ dày gà được sử dụng làm miễn dịch. Một kháng thể được chỉ định là B4, cho thấy sự phản ứng ưu tiên đối với actin cơ trơn ruột nhưng cũng phản ứng chéo với actin cơ vân, cơ tim và actin động mạch chủ dựa trên các kết quả từ các thử nghiệm immunoblots, thử nghiệm ELISA và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Tuy nhiên, kháng thể này không phản ứng với actin tế bào chất trong bất kỳ hệ thống thử nghiệm nào. Một kháng thể đơn dòng thứ hai, được chỉ định là C4, phản ứng với cả sáu isoactin được biết đến của động vật có xương sống cũng như actin trong Dictyostelium discoideum và Physarum polycephalum. Do đó, kháng thể B4 có vẻ như phản ứng với một epitope mà ít nhất một phần được chia sẻ giữa các actin cơ nhưng không có ở các actin tế bào chất, trong khi kháng thể C4 liên kết với một định danh kháng nguyên đã được bảo tồn rất cao giữa các actin. Các vị trí liên kết của cả hai kháng thể trên actin cơ vân chồng lên vị trí của DNase I của tuyến tụy. Cả hai kháng thể đều liên kết với một sản phẩm proteolytic SV8 gồm hai phần ba amino đầu của phân tử actin, và các epitope của chúng có vẻ như chồng lấn nhau vì C4 có thể cạnh tranh với sự liên kết của B4 với actin cơ vân. Không có kháng thể nào có khả năng ngăn chặn quá trình polymer hóa actin.

Các tế bào cơ trơn (SMC) thể hiện tính linh hoạt chức năng, điều chỉnh từ kiểu hình trưởng thành, trong đó chức năng chính là co bóp, đến trạng thái ít phân biệt hơn với khả năng tăng cường về khả năng vận động, tổng hợp protein và tăng sinh. Nghiên cứu hiện tại đã xác định, sử dụng phân tích Western, miễn dịch huỳnh quang kép và kính hiển vi huỳnh quang hội tụ, liệu sự thay đổi trong biểu hiện kiểu hình của tế bào SMC động mạch chủ thỏ trong nuôi cấy có thể được kết hợp với sự thay đổi trong biểu hiện và phân bố của các protein cấu trúc. Tế bào SMC ở trạng thái "co bóp" (ngày 1 và 3 của nuôi cấy sơ cấp) cho thấy sự phân loại rõ rệt các protein vào các miền tế bào, nhất quán với lý thuyết rằng cơ chế cấu trúc SMC được phân chia trong tế bào. Các protein chuyên biệt cho việc co bóp (α-SM actin, SM-MHC, và calponin) được biểu hiện cao trong các tế bào này và tập trung ở vùng trung tâm trên cùng của tế bào. Vimentin được giới hạn ở thân tế bào, cung cấp hỗ trợ cho thể co bóp nhưng không đồng thời phân bố với nó. Theo vai trò của nó trong gắn kết tế bào và vận động, β-NM actin được định vị ở ngoại vi tế bào và vỏ đáy. Protein cơ thể dày α-actinin được tập trung ở ngoại vi tế bào, có thể ổn định cả cơ chế co bóp và vận động. Các điểm nối chứa vinculin phát triển tốt, cho thấy sự bám dính mạnh của tế bào vào nền. Ở trạng thái "tổng hợp" SMC (các thí nghiệm từ 2-3 lần nuôi cấy), có sự giảm biểu hiện của các protein co bóp và protein gắn kết (vinculin) đi kèm với sự gia tăng các protein cytoskeletal (β-non-muscle [NM] actin và vimentin). Những thay đổi định lượng này trong các protein cấu trúc có liên quan đến những thay đổi mạnh mẽ về sự phân bố của chúng. Sự phân chia đặc trưng của các protein cấu trúc được quan sát thấy ở SMC trạng thái "co bóp" không còn rõ ràng nữa, với các protein phân phối đều hơn trong bào tương để thích ứng với sự thay đổi chức năng của tế bào. Vì vậy, việc điều chỉnh kiểu hình SMC không chỉ liên quan đến sự thay đổi định lượng trong các protein co bóp và cytoskeletal, mà còn là sự tổ chức lại các protein này. Do cytoskeleton hoạt động như một yếu tố điều chỉnh không gian của tín hiệu nội bào, sự tổ chức lại của cytoskeleton có thể dẫn đến việc định hình lại các phân tử tín hiệu, điều này có thể dẫn đến các thay đổi trong chức năng liên quan đến điều chỉnh kiểu hình SMC.

Các tế bào vừa là máy móc cơ học vừa là máy móc hóa học, và phần lớn năng lượng mà chúng tiêu thụ được sử dụng để tạo ra lực tác động lên nhau và lên ma trận ngoại bào xung quanh chúng. Bộ khung tế bào, màng tế bào và các macromolecule cấu thành nên ma trận ngoại bào tạo thành các mạng lưới mà cùng với các lực do tế bào tạo ra, tạo ra các vật liệu động với các tính chất nhớt đàn hồi độc đáo cho mỗi mô. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các lực mà tế bào tạo ra và chịu tác động, cũng như các tính chất cơ học của các vật liệu mà chúng bám vào, có thể có ảnh hưởng lớn đến cấu trúc và chức năng của tế bào, có thể hoạt động đồng bộ hoặc vượt qua các tín hiệu từ các kích thích hòa tan. Bài tổng quan ngắn này tóm tắt các nghiên cứu gần đây về tác động của cơ học trên bề mặt đến khả năng di động, sự phân biệt và sự tăng sinh của tế bào, và thảo luận về các cơ chế khả dĩ mà một tế bào có thể sử dụng để thăm dò độ cứng của môi trường xung quanh.

Các điểm bám tập trung (FAs) là các cụm lớn của các thụ thể xuyên màng thuộc họ integrin và nhiều protein “tấm” liên kết trong cytoplasmic, kết nối các thụ thể gắn với ma trận ngoại bào với bộ khung actin. Sự hình thành các FAs gần như tĩnh xác định ranh giới giữa mạng lưới actin dày đặc và động lực cao trong lamellipodium và tổ chức bộ khung ít dày đặc và đa dạng hơn trong lamella proper, tạo thành một mẫu cho việc tổ chức toàn bộ mạng lưới actin. Chức năng “cơ học” và “cảm nhận” chính của FAs; nghĩa là, sự nucleation và điều chỉnh các sợi căng thẳng chứa myosin-II và cảm nhận cơ học của các bề mặt bên ngoài phụ thuộc chủ yếu vào động học của các thành phần phân tử bên trong FAs. Một yếu tố trung tâm trong việc điều chỉnh FA liên quan đến vòng lặp phản hồi tích cực, dựa trên đặc điểm thú vị nhất của FAs; đó là sự phụ thuộc của chúng vào lực kéo cơ học phát triển bởi các sợi căng thẳng đang phát triển. FAs phát triển phản ứng với lực kéo như vậy, và nhanh chóng phân rã khi lực kéo này được giải phóng. Trong bài viết này, chúng tôi đề cập đến các mối quan hệ cơ chế giữa quá trình phát triển, trưởng thành và phân tách của FA và các sự kiện phân tử động học, diễn ra ở các vùng khác nhau của FA, chủ yếu ở đầu xa của cấu trúc này (mũi “toe”) và “gót” gần (gót “heel”), và thảo luận về vai trò trung tâm của các lực cơ học cục bộ trong việc phối hợp sự tương tác phức tạp giữa FAs và hệ thống actin. Cell Motil. Cytoskeleton 66: 1017–1029, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.

Mục đích của bài đánh giá này về spectrin là để xem xét các đặc tính chức năng của gia đình protein khung màng này. Các chủ đề chính bao gồm liên kết giữa spectrin và màng, liên kết giữa spectrin và sợi, vị trí của spectrin trong tế bào ở các loại tế bào khác nhau và thảo luận về sự khác biệt chức năng chính giữa spectrin thuộc dòng hồng cầu và không thuộc dòng hồng cầu. Điều này bao gồm một tóm tắt các nghiên cứu từ các phòng thí nghiệm của chúng tôi về sự so sánh chức năng và cấu trúc của các isoform spectrin ở động vật có vú, bao gồm một đơn vị alpha chung và một đơn vị beta đặc trưng cho mô. Do đó, sự khác biệt quan sát được giữa các spectrin này có thể được quy cho sự khác biệt trong các đặc tính của các đơn vị beta.

Chúng tôi gần đây đã tinh chế một protein kinase (CDPK) phụ thuộc canxi nhưng không phụ thuộc vào calmodulin và phospholipid từ các tế bào thực vật nuôi cấy (Harmon et al.: Plant Physiology 83:830–837, 1987). Một kháng thể đơn dòng (mAb 3B9) nhắm vào CDPK được sử dụng để xác định vị trí của protein này trong tế bào gốc của Allium và ống phấn của Tradescantia bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Mẫu nhuộm mAb 3B9 cho thấy CDPK được định vị trong một mạng lưới sợi trong tế bào chất giống như mạng lưới F‐actin trong giai đoạn giữa của chu kỳ tế bào. Việc điều trị mẫu mô với 10 μM cytochalasin D (CD) trước khi cố định đã xóa bỏ mẫu nhuộm. Các thí nghiệm định vị đôi, trong đó ống phấn trước tiên được nhuộm bằng mAb 3B9 và sau đó là rhodamine‐phalloidin (RP), đã chứng minh rằng CDPK và F‐actin có vị trí đồng thời. Kháng thể đơn dòng 3B9 không có phản ứng với actin tinh khiết từ cơ bắp thỏ hoặc Dictyostelium và không liên kết với các protein tương ứng với M_r của actin trong các chiết xuất thô từ đầu rễ của Allium và ống phấn của Tradescantia.

CDPK không phosphoryl hóa actin tinh khiết từ cơ bắp thỏ hoặc Dictyostelium trong vitro. Các nghiên cứu liên kết cho thấy rằng CDPK (1) không lắng đọng cùng với các sợi actin và (2) không hình thành phức hợp với G‐actin. Dữ liệu cho thấy mặc dù CDPK không tương tác trực tiếp với actin, nó có thể liên quan đến một protein liên kết actin và do đó có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh bộ xương tế bào thực vật.

Các thay đổi liên tiếp trong sự phân bố của vi ống trong quá trình phân hủy bào tương (GVBD), thụ tinh và nguyên phân đã được nghiên cứu bằng phương pháp kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với kháng thể chống vi ống trên một số loài trứng của động vật tunicate (Molgula occidentalis, Ciona savignyi, và Halocynthia roretzi). Những thay đổi này trong các mẫu vi ống cũng được liên kết với các chuyển động bào tương quan sát được. Một mạng lưới vi ống trong bào tương đã được quan sát trong suốt quá trình giảm phân. Trứng chưa được thụ tinh của M. occidentalis có một trục giảm phân nhỏ với các cực rộng; các cực trở nên tập trung sau khi kích hoạt trứng. Hai loài còn lại có các trục giảm phân điển hình hơn trước khi thụ tinh. Tại thời điểm thụ tinh, một aster tinh trùng lần đầu tiên xuất hiện gần vỏ trứng gần cực thực vật. Nó lớn lên thành một aster không đối xứng mạnh mẽ liên quan đến vỏ trứng. Aster tinh trùng nhanh chóng phát triển sau khi hình thành cơ thể cực thứ hai, và nó bị dời đến khu vực xích đạo, tương ứng với vị trí của sự xuất hiện myoplasmic, nửa sau của trứng. Nhân hiệu nữ di chuyển đến nhân hiệu nam ở trung tâm của aster tinh trùng. Mạng lưới vi ống và aster tinh trùng biến mất vào cuối của giai đoạn giữa đầu tiên chỉ còn lại một cấu trúc lưỡng cực nhỏ cho đến khi nguyên phân đầu tiên. Tại nguyên phân, các aster lớn lên một cách cực kỳ lớn trong khi trục nguyên phân vẫn rất nhỏ. Hai nhân con vẫn ở gần vị trí phân cắt ngay cả sau khi quá trình phân chia đã hoàn tất. Những kết quả này ghi nhận các thay đổi trong mẫu vi ống trong quá trình trưởng thành của noãn bào động vật tunicate, chứng minh rằng tinh trùng cung cấp centrosome hoạt động trong khi thụ tinh, và tiết lộ sự hiện diện của một thiết bị nguyên phân tại lần phân chia đầu tiên với một trục không đối xứng nhỏ và các aster khổng lồ.

ABP-50 là yếu tố kéo dài-1 alpha (EF-1 alpha) của Dictyostelium discoideum (Yang et al.: Nature 347:494–496, 1990). ABP-50 cũng là một protein liên kết và bó actin (Demma et al.: J. Biol. Chem. 265:2286–2291, 1990). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra sự phân đoạn của ABP-50 trong cả tế bào nghỉ và tế bào được kích thích. Kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch cho thấy rằng bên cạnh việc đồng hiện diện với F-actin ở các phần mở rộng bề mặt trong các tế bào không được kích thích, ABP-50 có sự phân bổ khuếch tán trong toàn bộ chất tế bào. Khi thêm cAMP, một chất hóa học thu hút, ABP-50 trở nên tập trung trong các filopodia được mở rộng như một phản ứng với sự kích thích. Việc định lượng ABP-50 trong các phân đoạn không tan và tan trong Triton của các tế bào nghỉ chỉ ra rằng 10% tổng lượng ABP-50 được phục hồi trong cytoskeleton Triton, trong khi phần còn lại nằm trong phân đoạn chất tế bào tan. Sự kích thích bằng cAMP làm tăng sự kết hợp của ABP-50 vào cytoskeleton Triton. Đỉnh điểm của sự kết hợp ABP-50 vào giây thứ 90 tương ứng với việc mở rộng filopod. Sự kết tủa miễn dịch ABP-50 trong chất tế bào từ các tế bào không được kích thích bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng tinh khiết affinity cho thấy sự kết tủa cùng với actin không sợi với ABP-50. ABP-50 tinh chế liên kết với G-actin với Kd khoảng 0.09 μM. Sự tương tác giữa ABP-50 và G-actin bị ức chế bởi GTP nhưng không bị GDP ức chế, trong khi việc bó lại của F-actin bởi ABP-50 không bị ảnh hưởng bởi các nucleotide guanine. Chúng tôi kết luận rằng một lượng đáng kể ABP-50 liên kết với G- hoặc F-actin in vivo và rằng sự tương tác giữa ABP-50 và F-actin trong cytoskeleton được điều chỉnh bởi sự kích thích hóa học.