Wiley

Sự điều chế kiểu hình của tế bào cơ trơn (SMC) liên quan đến những thay đổi đáng kể trong việc biểu hiện và tổ chức các protein co thắt và cytoskeletal, nhưng rất ít thông tin được biết về cách quá trình này được điều chỉnh. Nghiên cứu hiện tại đã sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào để điều tra khả năng tham gia của RhoA, một yếu tố điều chỉnh được biết đến của cytoskeleton actin. Trong tế bào SMC aorta thỏ được cấy vào nuôi cấy nguyên thủy với mật độ vừa phải, hoạt động của Rho cao tại hai thời điểm chức năng khác nhau, lần đầu khi tế bào điều chế sang kiểu hình "tổng hợp", và một lần nữa khi tế bào đạt độ dày và trở về kiểu hình "co thắt". Biểu hiện Rho gia tăng theo thời gian, đến mức biểu hiện tối đa xảy ra khi trở về trạng thái co thắt. Việc chuyển gen tạm thời các tế bào ở trạng thái tổng hợp với RhoA hoạt động liên tục (Val14RhoA) đã làm giảm kích thước tế bào và tái tổ chức các protein cytoskeletal giống như kiểu hình co thắt. Các sợi actin và myosin được đóng gói chặt chẽ và tổ chức cao trong khi vimentin tập trung ở vùng quanh nhân; các liên kết đính tâm điểm được phóng to và tập trung ở ngoại vi tế bào. Ngược lại, sự ức chế Rho nội sinh bằng enzym ngoại bào C3 dẫn đến mất hoàn toàn các sợi co thắt mà không ảnh hưởng đến sự phân bố của vimentin; các liên kết đính tâm điểm giảm về kích thước và số lượng. Việc điều trị các tế bào SMC ở trạng thái tổng hợp bằng các yếu tố điều chỉnh kiểu hình SMC đã biết, heparin và thrombin, đã gây ra sự gia tăng khiêm tốn trong hoạt động Rho. Sự đồng nhất kéo dài và việc thiếu serum đã khiến tế bào trở về kiểu hình co thắt hơn và điều này được tăng cường bởi heparin và thrombin. Các kết quả chỉ ra rằng RhoA đóng vai trò trong việc điều chỉnh kiểu hình SMC và cho thấy thêm rằng sự kích hoạt Rho bởi heparin và thrombin tương ứng với khả năng của các yếu tố này trong việc thúc đẩy kiểu hình co thắt. Cell Motil. Cytoskeleton 59:189–200, 2004. © 2004 Wiley‐Liss, Inc.

Sử dụng chủ yếu là kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm rhodamine‐phalloidin, phân phối F‐actin trong biểu mô thể thủy tinh của chuột đã được nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của tuổi tác, dòng di truyền và chấn thương cơ học.

Các nghiên cứu này đã cho thấy rằng ngoài việc liên kết với màng plasma, tổ chức cấu trúc của F‐actin trong biểu mô thể thủy tinh của chuột in situ được đặc trưng bởi hai cấu hình chính: (1) một bố trí sợi như là sợi căng thẳng, mạng lưới đa giác (PAs) và mạng lưới, và (2) một cấu trúc đặc tập trung gọi là bó actin bị hạn chế (SAB).

Nghiên cứu tuổi cho thấy rằng SAB là một đặc điểm nhất quán ở chuột C57BL/6 từ 5 tuần tuổi trở đi, nhưng không có ở chuột CF1. Kích thước và hình dạng của SAB thay đổi dần theo tuổi tác như suy diễn từ các phép đo hai chiều. Nghiên cứu di truyền về đặc điểm SAB sử dụng các dòng lai và dòng đồng hợp tử cho thấy điều này được di truyền theo kiểu trội Mendel, có thể là đa gen. Cuối cùng, nghiên cứu chấn thương tiết lộ một sự thay đổi cấu trúc ở các tế bào xung quanh vết thương, bao gồm sự phẳng hóa của các tế bào ở cạnh vết thương và sự kéo dài các quá trình vào không gian vết thương. Ở phần còn lại của biểu mô, chấn thương làm gia tăng sự gấp nếp của màng và độ huỳnh quang của các mạng lưới đa giác nhưng làm giảm kích thước và cường độ huỳnh quang của SAB. Những thay đổi này được cho là có liên quan đến quá trình sửa chữa vết thương liên quan đến sự phân chia và di cư tế bào.

Các nghiên cứu này minh hoạ sự biến đổi trong biểu hiện F‐actin in situ ở các tế bào biểu mô thể thủy tinh mà có thể được kích thích bởi các yếu tố nội tại và ngoại tại.

Mặc dù hemidesmosome ở tế bào biểu bì động vật có vú có vẻ bề ngoài tương tự một nửa của desmosome ở cấp độ siêu cấu trúc, việc kiểm tra cấu trúc của các mảng dưới màng electron-đậm của hemidesmosome và desmosome cho thấy chúng khác nhau về hình thái tổng thể và kích thước. Dựa trên những phát hiện này, chúng tôi tự hỏi liệu các thành phần của desmosome có hiện diện trong hemidesmosome hay không. Để xác định điều này, chúng tôi đã chuẩn bị một số mô biểu bì vảy phân lớp để thực hiện miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bằng cách sử dụng các chế phẩm kháng thể đã được chỉ định chống lại các thành phần desmosome đã biết bao gồm desmoplakin và một số glycoprotein. Các chế phẩm kháng thể này không cho thấy phản ứng với hemidesmosome theo các tiêu chí miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Chúng tôi cũng đã sử dụng các kháng thể tự miễn của pemphigoid bọng nước (BP) đã được chứng minh nhận diện hemidesmosome trong các tế bào da động vật có vú [Mutasim et al., J. Invest. Derm., 84:47–53, 1985]. Quan sát miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với dấu đôi của da chuột sơ sinh được chuẩn bị bằng các kháng thể desmoplakin và kháng thể tự miễn BP cho thấy hemidesmosome được nhuộm bởi kháng thể tự miễn BP không được nhận diện bởi các kháng thể desmoplakin. Chúng tôi đã xác nhận những phát hiện này ở cấp độ siêu cấu trúc bằng phương pháp định vị miễn dịch vàng gián tiếp của các kháng thể desmoplakin và kháng thể tự miễn BP. Do đó, hemidesmosome dường như không phải là một nửa của desmosome và có thể có tổ chức phân tử rất khác biệt so với desmosome. Chúng tôi đưa ra khả năng rằng sự biến đổi giữa hemidesmosome và desmosome mà chúng tôi phát hiện ở mức độ hình thái và miễn dịch có thể phản ánh những khác biệt chức năng của hai loại khớp này.

Các vi ống đã được lắp ráp từ tubulin tinh khiết trong dung dịch đệm được sử dụng để nghiên cứu sự không ổn định động (100 mM PIPES, 2 mM EGTA, 1 mM magie, 0.2 mM GTP) và sau đó được pha loãng trong cùng một dung dịch đệm để nghiên cứu tốc độ phân rã. Sau khi pha loãng gấp 15 lần, polymer vi ống giảm tuyến tính còn khoảng 20% so với giá trị ban đầu trong 15 giây. Chúng tôi đã xác định phân bố chiều dài của các vi ống trước khi pha loãng và chuẩn bị các mô phỏng máy tính về sự mất polymer với các tốc độ phân rã giả định khác nhau. Dữ liệu thí nghiệm của chúng tôi nhất quán với tốc độ phân rã trên mỗi vi ống là 60 μm/phút. Đây là tổng tốc độ phân hủy của các vi ống trong giai đoạn rút ngắn nhanh, được xác định bằng kính hiển vi ánh sáng của các vi ống đơn lẻ (Walker et al.: Tạp chí Sinh học Tế bào 107:1437–1448, 1988). Vì vậy, chúng tôi kết luận rằng các vi ống bắt đầu rút ngắn nhanh ở cả hai đầu khi pha loãng. Hơn nữa, vì chúng tôi không thể phát hiện ra sự chậm trễ giữa việc pha loãng và sự bắt đầu của sự phân rã nhanh, chuyển đổi từ kéo dài sang rút ngắn nhanh dường như xảy ra trong vòng 1 giây sau khi pha loãng. Giả định rằng sự chuyển đổi này (thảm họa) liên quan đến sự mất mũ GTP, và rằng việc mất mũ đạt được thông qua sự phân tách tuần tự của các đơn vị GTP-tubulin sau khi pha loãng, chúng tôi có thể ước tính kích thước tối đa của mũ dựa trên dữ liệu động học và diễn giải mô hình của Walker et al. Mũ có khả năng ngắn hơn 40 và 20 đơn vị ở các đầu dương và âm, tương ứng.

Phép thử chữa lành vết thương do trầy xước là một phương pháp nhạy cảm để đặc trưng hóa sự tăng sinh và di chuyển của tế bào, nhưng khó có thể đánh giá định lượng. Do đó, chúng tôi đã phát triển một thử nghiệm dựa trên phát hiện huỳnh quang hồng ngoại theo thời gian thực để định lượng nhạy cảm và chính xác sự di chuyển của tế bào trong ống nghiệm. Phương pháp này cung cấp độ nhạy, tính đơn giản và khả năng tích hợp vào các nghiên cứu sàng lọc quy mô lớn tự động. Một chất đánh dấu ưa mỡ nhuộm tế bào live—1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indotricarbocyanine iodide (DiR)—được sử dụng để hình ảnh hóa chính xác việc đóng vết thương trong bài kiểm tra trầy xước 96 giếng đơn giản. Các vết trầy xước được tạo ra trên những lớp tế bào đồng nhất đã nhuộm sẵn bằng đầu pipette và được quét ở các khoảng thời gian khác nhau bằng máy quét huỳnh quang. Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Image J và chỉ số di chuyển được tính toán. Ảnh hưởng của số lượng tế bào, thời gian sau khi gây trầy xước và cài đặt phần mềm được phân tích. Phương pháp này được xác minh bằng cách cho thấy các hiệu ứng phụ thuộc vào nồng độ và thời gian của cytochalasin-D trên sự di chuyển của nguyên bào sợi. Sử dụng thử nghiệm này, chúng tôi đánh giá định lượng vai trò của các kinase protein được kích hoạt bởi MAPK MK2 và MK3 trong sự di chuyển của nguyên bào sợi. Đầu tiên, kiểu hình di chuyển của MEF thiếu MK2 được phân tích trong một mô hình cứu sống retroviral. Ngoài ra, sự di chuyển của các tế bào thiếu MK2/3 đôi được xác định và khả năng của MK3 trong việc cứu sống sự di chuyển tế bào trong các nguyên bào sợi thiếu MK2/3 đôi được chứng minh. Cell Motil. Cytoskeleton 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.

Curcumin là một phytochemical trong chế độ ăn uống có liên quan đến các tác động chống u, nhưng các cơ chế mà nó ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Chẳng hạn, có rất ít thông tin về tác động của curcumin đối với tổ chức và chức năng của bộ xương tế bào. Trong nghiên cứu này, các phương pháp video thời gian thực và đánh dấu miễn dịch huỳnh quang đã được sử dụng để chứng minh rằng curcumin thay đổi đáng kể tổ chức vi sợi và sự di động của tế bào trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt người PC-3 và LNCaP trong ống nghiệm. Curcumin nhanh chóng ngăn chặn các chuyển động của tế bào và sau đó thay đổi hình dạng tế bào ở dòng tế bào PC-3 có tính di động cao, nhưng có tác động ít hơn đối với dòng tế bào LNCaP tương đối ít di động. Các sợi căng thẳng được gia tăng và tổng lượng f-actin dường như tăng lên ở cả hai loại tế bào sau khi điều trị với curcumin. Cytochalasin B (CB) làm rối loạn tổ chức vi sợi trong cả hai dòng tế bào, và gây ra sự phồng màng mạnh mẽ ở các tế bào PC-3, nhưng không ở các tế bào LNCaP. Việc điều trị trước cho các tế bào bằng curcumin ức chế các thay đổi trong tổ chức vi sợi do CB gây ra, và chặn hiện tượng phồng màng ở PC-3. Ít nhất một phần của các tác động của curcumin dường như được điều hòa bởi protein kinase C (PKC), vì việc điều trị với tác nhân ức chế PKC bisindolylmaleimide làm giảm khả năng của curcumin trong việc chặn hiện tượng phồng màng do CB gây ra. Những phát hiện này cho thấy curcumin có tác động đáng kể lên bộ xương actin trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt, bao gồm việc thay đổi tổ chức và chức năng vi sợi. Đây là một quan sát mới mẻ có thể đại diện cho một cơ chế quan trọng mà qua đó curcumin hoạt động như một tác nhân ngăn ngừa ung thư, cũng như một chất ức chế sự tạo mạch và di căn. Cell Motil. Cytoskeleton 58:253–268, 2004. © 2004 Wiley‐Liss, Inc.

ABP-50 là yếu tố kéo dài-1 alpha (EF-1 alpha) của Dictyostelium discoideum (Yang et al.: Nature 347:494–496, 1990). ABP-50 cũng là một protein liên kết và bó actin (Demma et al.: J. Biol. Chem. 265:2286–2291, 1990). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra sự phân đoạn của ABP-50 trong cả tế bào nghỉ và tế bào được kích thích. Kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch cho thấy rằng bên cạnh việc đồng hiện diện với F-actin ở các phần mở rộng bề mặt trong các tế bào không được kích thích, ABP-50 có sự phân bổ khuếch tán trong toàn bộ chất tế bào. Khi thêm cAMP, một chất hóa học thu hút, ABP-50 trở nên tập trung trong các filopodia được mở rộng như một phản ứng với sự kích thích. Việc định lượng ABP-50 trong các phân đoạn không tan và tan trong Triton của các tế bào nghỉ chỉ ra rằng 10% tổng lượng ABP-50 được phục hồi trong cytoskeleton Triton, trong khi phần còn lại nằm trong phân đoạn chất tế bào tan. Sự kích thích bằng cAMP làm tăng sự kết hợp của ABP-50 vào cytoskeleton Triton. Đỉnh điểm của sự kết hợp ABP-50 vào giây thứ 90 tương ứng với việc mở rộng filopod. Sự kết tủa miễn dịch ABP-50 trong chất tế bào từ các tế bào không được kích thích bằng cách sử dụng kháng thể đa dòng tinh khiết affinity cho thấy sự kết tủa cùng với actin không sợi với ABP-50. ABP-50 tinh chế liên kết với G-actin với Kd khoảng 0.09 μM. Sự tương tác giữa ABP-50 và G-actin bị ức chế bởi GTP nhưng không bị GDP ức chế, trong khi việc bó lại của F-actin bởi ABP-50 không bị ảnh hưởng bởi các nucleotide guanine. Chúng tôi kết luận rằng một lượng đáng kể ABP-50 liên kết với G- hoặc F-actin in vivo và rằng sự tương tác giữa ABP-50 và F-actin trong cytoskeleton được điều chỉnh bởi sự kích thích hóa học.

Các thay đổi liên tiếp trong sự phân bố của vi ống trong quá trình phân hủy bào tương (GVBD), thụ tinh và nguyên phân đã được nghiên cứu bằng phương pháp kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với kháng thể chống vi ống trên một số loài trứng của động vật tunicate (Molgula occidentalis, Ciona savignyi, và Halocynthia roretzi). Những thay đổi này trong các mẫu vi ống cũng được liên kết với các chuyển động bào tương quan sát được. Một mạng lưới vi ống trong bào tương đã được quan sát trong suốt quá trình giảm phân. Trứng chưa được thụ tinh của M. occidentalis có một trục giảm phân nhỏ với các cực rộng; các cực trở nên tập trung sau khi kích hoạt trứng. Hai loài còn lại có các trục giảm phân điển hình hơn trước khi thụ tinh. Tại thời điểm thụ tinh, một aster tinh trùng lần đầu tiên xuất hiện gần vỏ trứng gần cực thực vật. Nó lớn lên thành một aster không đối xứng mạnh mẽ liên quan đến vỏ trứng. Aster tinh trùng nhanh chóng phát triển sau khi hình thành cơ thể cực thứ hai, và nó bị dời đến khu vực xích đạo, tương ứng với vị trí của sự xuất hiện myoplasmic, nửa sau của trứng. Nhân hiệu nữ di chuyển đến nhân hiệu nam ở trung tâm của aster tinh trùng. Mạng lưới vi ống và aster tinh trùng biến mất vào cuối của giai đoạn giữa đầu tiên chỉ còn lại một cấu trúc lưỡng cực nhỏ cho đến khi nguyên phân đầu tiên. Tại nguyên phân, các aster lớn lên một cách cực kỳ lớn trong khi trục nguyên phân vẫn rất nhỏ. Hai nhân con vẫn ở gần vị trí phân cắt ngay cả sau khi quá trình phân chia đã hoàn tất. Những kết quả này ghi nhận các thay đổi trong mẫu vi ống trong quá trình trưởng thành của noãn bào động vật tunicate, chứng minh rằng tinh trùng cung cấp centrosome hoạt động trong khi thụ tinh, và tiết lộ sự hiện diện của một thiết bị nguyên phân tại lần phân chia đầu tiên với một trục không đối xứng nhỏ và các aster khổng lồ.

Chúng tôi gần đây đã tinh chế một protein kinase (CDPK) phụ thuộc canxi nhưng không phụ thuộc vào calmodulin và phospholipid từ các tế bào thực vật nuôi cấy (Harmon et al.: Plant Physiology 83:830–837, 1987). Một kháng thể đơn dòng (mAb 3B9) nhắm vào CDPK được sử dụng để xác định vị trí của protein này trong tế bào gốc của Allium và ống phấn của Tradescantia bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Mẫu nhuộm mAb 3B9 cho thấy CDPK được định vị trong một mạng lưới sợi trong tế bào chất giống như mạng lưới F‐actin trong giai đoạn giữa của chu kỳ tế bào. Việc điều trị mẫu mô với 10 μM cytochalasin D (CD) trước khi cố định đã xóa bỏ mẫu nhuộm. Các thí nghiệm định vị đôi, trong đó ống phấn trước tiên được nhuộm bằng mAb 3B9 và sau đó là rhodamine‐phalloidin (RP), đã chứng minh rằng CDPK và F‐actin có vị trí đồng thời. Kháng thể đơn dòng 3B9 không có phản ứng với actin tinh khiết từ cơ bắp thỏ hoặc Dictyostelium và không liên kết với các protein tương ứng với M_r của actin trong các chiết xuất thô từ đầu rễ của Allium và ống phấn của Tradescantia.

CDPK không phosphoryl hóa actin tinh khiết từ cơ bắp thỏ hoặc Dictyostelium trong vitro. Các nghiên cứu liên kết cho thấy rằng CDPK (1) không lắng đọng cùng với các sợi actin và (2) không hình thành phức hợp với G‐actin. Dữ liệu cho thấy mặc dù CDPK không tương tác trực tiếp với actin, nó có thể liên quan đến một protein liên kết actin và do đó có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh bộ xương tế bào thực vật.

Mục đích của bài đánh giá này về spectrin là để xem xét các đặc tính chức năng của gia đình protein khung màng này. Các chủ đề chính bao gồm liên kết giữa spectrin và màng, liên kết giữa spectrin và sợi, vị trí của spectrin trong tế bào ở các loại tế bào khác nhau và thảo luận về sự khác biệt chức năng chính giữa spectrin thuộc dòng hồng cầu và không thuộc dòng hồng cầu. Điều này bao gồm một tóm tắt các nghiên cứu từ các phòng thí nghiệm của chúng tôi về sự so sánh chức năng và cấu trúc của các isoform spectrin ở động vật có vú, bao gồm một đơn vị alpha chung và một đơn vị beta đặc trưng cho mô. Do đó, sự khác biệt quan sát được giữa các spectrin này có thể được quy cho sự khác biệt trong các đặc tính của các đơn vị beta.