Manoj B. Menon1, Natalia Ronkina2, Jessica Schwermann2, Alexey Kotlyarov2, Matthias Gaestel2
1Institute of Biochemistry, Hannover Medical School, Carl-Neuberg-Strasse 1, Hannover, Germany.
2Institute of Biochemistry, Hannover Medical School, Hannover, Germany
Tóm tắt
Tóm tắtPhép thử chữa lành vết thương do trầy xước là một phương pháp nhạy cảm để đặc trưng hóa sự tăng sinh và di chuyển của tế bào, nhưng khó có thể đánh giá định lượng. Do đó, chúng tôi đã phát triển một thử nghiệm dựa trên phát hiện huỳnh quang hồng ngoại theo thời gian thực để định lượng nhạy cảm và chính xác sự di chuyển của tế bào trong ống nghiệm. Phương pháp này cung cấp độ nhạy, tính đơn giản và khả năng tích hợp vào các nghiên cứu sàng lọc quy mô lớn tự động. Một chất đánh dấu ưa mỡ nhuộm tế bào live—1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indotricarbocyanine iodide (DiR)—được sử dụng để hình ảnh hóa chính xác việc đóng vết thương trong bài kiểm tra trầy xước 96 giếng đơn giản. Các vết trầy xước được tạo ra trên những lớp tế bào đồng nhất đã nhuộm sẵn bằng đầu pipette và được quét ở các khoảng thời gian khác nhau bằng máy quét huỳnh quang. Hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Image J và chỉ số di chuyển được tính toán. Ảnh hưởng của số lượng tế bào, thời gian sau khi gây trầy xước và cài đặt phần mềm được phân tích. Phương pháp này được xác minh bằng cách cho thấy các hiệu ứng phụ thuộc vào nồng độ và thời gian của cytochalasin-D trên sự di chuyển của nguyên bào sợi. Sử dụng thử nghiệm này, chúng tôi đánh giá định lượng vai trò của các kinase protein được kích hoạt bởi MAPK MK2 và MK3 trong sự di chuyển của nguyên bào sợi. Đầu tiên, kiểu hình di chuyển của MEF thiếu MK2 được phân tích trong một mô hình cứu sống retroviral. Ngoài ra, sự di chuyển của các tế bào thiếu MK2/3 đôi được xác định và khả năng của MK3 trong việc cứu sống sự di chuyển tế bào trong các nguyên bào sợi thiếu MK2/3 đôi được chứng minh. Cell Motil. Cytoskeleton 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.
