Traffic

Các sự kiện chính trong sự vận chuyển tế bào diễn ra tại bề mặt tế bào, và việc quan sát những sự kiện này mà không bị can thiệp từ các vùng sâu hơn là điều mong muốn. Bài tổng quan này mô tả một kỹ thuật kính hiển vi dựa trên huỳnh quang phản xạ toàn phần, rất thích hợp cho việc cắt lớp quang học tại các vùng tế bào-cơ chất với một vùng kích thích huỳnh quang nguyên thủy rất mỏng. Kỹ thuật này còn có nhiều ứng dụng khác, nổi bật nhất là nghiên cứu động học sinh học hóa học và động lực học của các sinh vật phân tử đơn lẻ tại bề mặt. Một tóm tắt ngắn gọn về những ứng dụng này được cung cấp, tiếp theo là trình bày cơ sở vật lý cho kỹ thuật này và các cách thức khác nhau để triển khai huỳnh quang phản xạ toàn phần trong một kính hiển vi huỳnh quang thông thường.

Bài viết này tóm tắt các con đường và vị trí tổng hợp của các phospholipid chính ở động vật có vú. Các cơ chế được đề xuất cho việc vận chuyển phospholipid giữa các bào quan trong tế bào động vật có vú được thảo luận, bao gồm việc vận chuyển thông qua sự khuếch tán monomer tự phát, protein vận chuyển phospholipid trong bào tương, vận chuyển qua bóng màng và vận chuyển không qua bóng màng của phospholipid giữa các bào quan thông qua các vị trí tiếp xúc màng, bao gồm cả sự di chuyển của phospholipid từ lưới nội sinh đến ty thể thông qua các màng liên kết với ty thể.

Các nghiên cứu hình thái học và sinh hóa đã chỉ ra rằng các autophagosome hòa hợp với các endosome tạo thành các amphisome, một bào quan lai tiền lysosome. Trong báo cáo hiện tại, chúng tôi đã phân tích quá trình này trong các tế bào K562, một dòng tế bào bạch cầu hồng cầu gây ra thể đa bào (MVB) và giải phóng các bào quan nội bào được gọi là exosome vào môi trường ngoài tế bào. Chúng tôi đã trước đó chỉ ra rằng trong các tế bào K562, Rab11 trang trí các MVB. Do đó, để nghiên cứu ở cấp độ phân tử sự tương tác của các MVB với con đường tự thực, chúng tôi đã khảo sát bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng nhất số phận của các MVB trong các tế bào quá biểu hiện protein huỳnh quang xanh (GFP)–Rab11 và protein autophagosomal protein huỳnh quang đỏ–chuỗi nhẹ 3 (LC3). Các tác nhân kích thích tự thực như đói hoặc rapamycin đã gây ra sự phình to của các bào quan trang trí với GFP–Rab11 và một sự đồng vị đáng kể với LC3. Sự hội tụ này đã bị ngăn chặn bởi một đột biến Rab11 thống trị tiêu cực, cho thấy một Rab11 chức năng có liên quan đến sự tương tác giữa các MVB và con đường tự thực. Thú vị là, chúng tôi đã trình bày bằng chứng rằng việc kích thích tự thực đã gây ra sự tích lũy canxi trong các khoang tự thực. Hơn nữa, sự hội tụ giữa các con đường endosomal và tự thực đã bị giảm nhẹ bởi chelator Ca²⁺ acetoxymethyl ester (AM) của chelator canxi 1,2‐bis(o‐aminophenoxy)ethane‐N,N,N′,N′‐tetraacetic acid (BAPTA), cho thấy rằng sự hòa hợp của các MVB với khoang autophagosome là một sự kiện phụ thuộc vào canxi. Ngoài ra, việc kích thích tự thực hoặc quá biểu hiện LC3 đã ức chế sự giải phóng exosome, cho thấy rằng trong các điều kiện kích thích tự thực, các MVB được hướng đến con đường tự thực với sự ức chế ngược lại trong việc giải phóng exosome.

Sự thiếu hụt dinh dưỡng ở tế bào eukaryotic gây ra nhiều phản ứng căng thẳng khác nhau, bao gồm cả tự thực bào. Tự thực bào được thực hiện bởi các autophagosome, chúng thu thập các thành phần và bào quan trong tế bào để phân hủy sau khi kết hợp với các endosome chứa protease. Để xác định vai trò của vi ống trong quá trình tự thực bào, chúng tôi đã sử dụng nocodazole và vinblastine để phá vỡ vi ống và đo lường độc lập sự hình thành và kết hợp của autophagosome trong tế bào gan chuột cống nguyên thủy. Bằng cách đo lường sự chuyển vị của GFP‐LC3, một dấu hiệu của autophagosome, vào autophagosome và sự lipid hóa của GFP‐LC3, chúng tôi đã định lượng tỷ lệ và mức độ hình thành autophagosome. Sự đói ăn làm tăng cả tỷ lệ hình thành autophagosome so với mức cơ bản và tổng số autophagosome trên mỗi tế bào. Sự hình thành autophagosome tối đa yêu cầu hệ thống vi ống nguyên vẹn. Sự kết hợp của autophagosome với endosome, được thử nghiệm bằng cách xác định độ nhạy với chất ức chế protease cũng như sự chồng chéo với các endosome dương tính với LysoTracker Red, yêu cầu vi ống nguyên vẹn. Hình ảnh tế bào sống cho thấy autophagosome là những cấu trúc có thể di chuyển, và chuyển động của chúng cũng yêu cầu vi ống. Điều thú vị là vinblastine đã kích thích sự hình thành autophagosome gấp đôi trước khi có bất kỳ thay đổi rõ rệt nào trong hệ thống vi ống được phát hiện. Sự kích thích hình thành autophagosome bởi vinblastine không phụ thuộc vào dinh dưỡng và hoạt động của mTOR nhưng bị ức chế bởi sự thiếu hụt các protein tự thực bào Atg5 và Atg6, được biết là cần thiết cho quá trình tự thực bào.

Một cuộc sàng lọc biểu hiện từ thư viện cDNA của chuột đã xác định được một protein với cấu trúc mới rõ rệt, tức là protein này có cả miền xuyên màng đầu N và một móc glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) ở đầu C. Dữ liệu của chúng tôi xác nhận điều này. Do đó, protein này sẽ có một cấu trúc mà ở các tế bào động vật có vú, chỉ được chia sẻ bởi một loại hình topological isoform nhỏ, nhưng quan trọng về bệnh lý, của protein prion (PrP). Tương đồng với con người của protein này đã được mô tả trước đây (BST-2 hoặc kháng nguyên HM1.24) như một phân tử bề mặt tế bào, dường như liên quan đến sự phát triển của tế bào tiền B trong giai đoạn đầu và có mặt ở nồng độ cao trên bề mặt của tế bào myeloma. Chúng tôi cho thấy rằng rat BST-2/HM1.24 có cả vị trí bề mặt tế bào và vị trí nội bào (mô gần nhân) và được nội hóa hiệu quả từ bề mặt tế bào. Chúng tôi cũng cho thấy rằng kho dự trữ bề mặt tế bào của BST-2/HM1.24 chủ yếu hiện diện trong màng bào tương đỉnh của các tế bào phân cực. Thực tế là rat BST-2/HM1.24 dường như sở hữu một móc GPI khiến chúng tôi suy đoán rằng nó có thể tồn tại trong các miền lipid phong phú cholesterol (các mảng lipid) tại màng bào tương. Dữ liệu từ một số thí nghiệm xác nhận vị trí này. Chúng tôi trình bày một mô hình trong đó BST-2/HM1.24 giúp liên kết các mảng lipid kề nhau trong màng bào tương.

Macroautophagy, một quá trình xảy ra liên tục trong các tế bào eukaryote bậc cao, chịu trách nhiệm phân hủy nhiều protein và bào quan lâu dài. Những sự kiện thực tế diễn ra trong suốt quá trình này trong một hệ thống động của một tế bào sống chưa bao giờ được nghiên cứu một cách thấu đáo. Chúng tôi nhằm phát triển một thử nghiệm trên tế bào sống, trong đó theo dõi toàn bộ lộ trình của một autophagosome. Các thí nghiệm của chúng tôi cho thấy autophagosomes được hình thành một cách ngẫu nhiên ở các vùng ngoại vi của tế bào. Sau đó, chúng di chuyển theo hai chiều dọc theo vi ống, tích tụ tại trung tâm tổ chức vi ống, theo cách tương tự như lysosome. Sự di chuyển hướng tâm của chúng phụ thuộc vào protein vận chuyển dynein và rất quan trọng cho sự hợp nhất của chúng với lysosome. Ban đầu, autophagosomes ghép nối với lysosome, không phụ thuộc vào việc axit hóa lysosome. Hai loại hợp nhất diễn ra sau đó: hợp nhất hoàn toàn, tạo ra một bào quan lai, hoặc thường xuyên hơn là hợp nhất kiss‐and‐run, tức là chuyển giao một số nội dung trong khi vẫn duy trì hai bọng túi riêng biệt. Thật bất ngờ, ngăn chứa autophagolysosomal có vẻ tồn tại lâu hơn dự kiến. Nghiên cứu của chúng tôi ghi lại nhiều khía cạnh của hành vi autophagosome, bổ sung cho sự hiểu biết của chúng tôi về cơ chế và kiểm soát quá trình tự thực bào. Thực vậy, mặc dù sự hình thành autophagosomes hoàn toàn khác với bất kỳ cấu trúc bọng túi nào khác, lộ trình sau đó của chúng dường như rất giống với những con đường vận chuyển khác.

Gen mẫn cảm u ở động vật có xương sống tsg101 mã hóa đồng hình với Vps23p, một loại protein Vps nhóm E quan trọng cho quá trình vận chuyển màng bình thường trong thể nội bào muộn/cơ thể đa bào của nấm men. Cả hai protein đều kết hợp thành các phức hợp protein lớn (~350 kDa) trong tế bào chất và chúng tôi chỉ ra rằng phức hợp nấm men chứa một loại protein Vps nhóm E khác, Vps28p. Các tế bào đột biến tsg101 thể hiện các khuyết tật trong việc phân loại và trưởng thành phân hủy proteolytic của hydrolase lysosomal cathepsin D, cũng như trong sự phân bố trạng thái ổn định của thụ thể manose-6-phosphate. Ngoài ra, các thụ thể EGF đã được nội hóa mà thường được phân loại đến lysosome thì lại được tái chế trở lại bề mặt tế bào một cách nhanh chóng trong các tế bào đột biến tsg101. Chúng tôi đề xuất rằng các tế bào đột biến tsg101 bị khuyết tật trong việc giao hàng các protein hàng hóa đến các khoang nội bào muộn. Một hệ quả của khuyết tật vận chuyển nội bào này là sự điều chỉnh/bẻ gãy các thụ thể bề mặt tế bào đã kích hoạt bị trì hoãn, dẫn đến việc tín hiệu kéo dài. Điều này có thể góp phần vào kiểu hình gây ung thư được thể hiện bởi các fibroblast đột biến tsg101.

Các rafts đã được hình thành như những bất đồng nhất bên cạnh trong tổ chức cholesterol và sphingolipid, được trang bị chức năng phân loại và tín hiệu. Trong bài tổng quan này, chúng tôi xem xét một cách nghiêm túc bằng chứng cho điều cốt lõi của ‘giả thuyết raft’, cụ thể là sự phân tách phụ thuộc lipid của các thành phần màng cụ thể trong màng tế bào. Chúng tôi cho rằng các phương pháp tiếp cận truyền thống trong việc nghiên cứu tổ chức raft, trong đó màng được coi là các hệ thống thụ động, cân bằng nhiệt, ít có khả năng cung cấp một khuôn khổ đầy đủ để hiểu các cơ chế tổ chức raft in vivo. Một quan điểm mới nổi về tổ chức raft là nó được điều chỉnh theo không gian-thời gian ở các quy mô khác nhau bởi tế bào. Điều này lập luận rằng các rafts phải được xác định bằng sự quan sát đồng thời các thành phần tham gia vào các chức năng cụ thể. Bằng chứng gần đây từ nghiên cứu các protein neo-glycosylphosphatidyl inositol, một dấu hiệu rafts phổ biến, hỗ trợ hình ảnh này, trong đó các rafts quy mô lớn hơn, ổn định hơn được sinh ra từ các cấu trúc phụ thuộc lipid quy mô nhỏ, được duy trì tích cực bởi các quá trình tế bào.

Sự tạo ra axit phosphatidic tại chỗ đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh vận chuyển màng tế bào nội bào qua các cơ chế mà chủ yếu vẫn chưa được biết rõ. Axit phosphatidic có thể thu hút và kích hoạt các yếu tố tiếp theo, hoặc thay đổi tính chất sinh lý của màng và trực tiếp gây ra sự uốn cong và/hoặc không ổn định của màng. Để đánh giá những khả năng này, chúng tôi đã xác định các thuộc tính pha của axit phosphatidic và axit lysophosphatidic dưới các điều kiện sinh lý của pH và nồng độ ion. Trong các hệ thống lipid đơn, axit phosphatidic không bão hòa hoạt động như một lipid ưa thích cấu trúc hình trụ, hai lớp ở điều kiện tế bào chất (37 °C, pH 7.2, 0.5 mm Mg²⁺ tự do), nhưng đã có hình dạng loại II dưới các điều kiện trong Golgi điển hình, với pH hơi axit và nồng độ Ca²⁺ dưới 1mmol/l (pH 6.6–5.9, 0.3 mm Ca²⁺). Axit lysophosphatidic tạo ra micelle lipid loại I trong điều kiện không có cation hóa trị hai, nhưng lại hình thành các phức hợp lipid bilayer anhydrous cation-lysophosphatidic khi có mặt. Những dữ liệu này gợi ý rằng axit phosphatidic và axit lysophosphatidic có hình dạng phân tử tương tự ở điều kiện tế bào chất; tuy nhiên, các thí nghiệm trong hệ thống lipid hỗn hợp cho thấy rằng hình dạng của chúng không hoàn toàn giống nhau. Axit lysophosphatidic đã ổn định pha bilayer của phosphatidylethanolamine không bão hòa, trong khi hiệu ứng ngược lại được quan sát thấy khi có mặt axit phosphatidic. Những kết quả này hỗ trợ giả thuyết rằng việc chuyển đổi axit lysophosphatidic thành axit phosphatidic bởi endophilin hoặc BARS (50 kDa chất nền ribosyl hóa brefeldin A) có thể gây ra độ cong lớp đơn tự phát âm tính và điều chỉnh sự phân chia màng nội bào và Golgi. Các mô hình thay thế cho việc điều chỉnh sự phân chia màng dựa trên sự phụ thuộc mạnh mẽ của hình dạng phân tử của (lyso)phosphatidic acid vào pH và cation hóa trị hai cũng được thảo luận.

Uroepithelium lót bề mặt bên trong của bể thận, niệu quản và bàng quang nước tiểu, nơi nó tạo thành một rào cản kín giúp giữ nước tiểu, trong khi ngăn chặn sự di chuyển không được kiểm soát của các ion, chất tan và các chất chuyển hóa độc hại qua rào cản biểu mô. Trong trường hợp của bàng quang, rào cản thẩm thấu phải được duy trì ngay cả khi cơ quan này trải qua các thay đổi chu kỳ về áp suất khi nó đầy và xả. Ngoài việc làm sâu sắc thêm hiểu biết của chúng ta về chức năng của rào cản, phân tích mới về uroepithelium đang cung cấp thông tin về cách mà các miền màng/protein không hòa tan trong chất tẩy rửa được gọi là các tấm được hình thành tại màng bề mặt của các tế bào ô dù, cách mà các kích thích cơ học như áp suất thay đổi lưu thông bài tiết và nội tiết trong các tế bào biểu mô như tế bào ô dù, và cách mà các thay đổi về áp suất được truyền đạt đến hệ thần kinh bên dưới.