Molecular Microbiology

Quá trình hình thành các cộng đồng vi khuẩn phức tạp được gọi là màng sinh học bắt đầu với sự tương tác của các tế bào trôi nổi với bề mặt để đáp ứng các tín hiệu môi trường thích hợp. Chúng tôi báo cáo việc phân lập và đặc điểm hóa của các đột biến Pseudomonas aeruginosa PA14 có khiếm khuyết trong việc bắt đầu hình thành màng sinh học trên bề mặt vô cơ, nhựa polyvinylcloride (PVC). Các đột biến này được gọi là khiếm khuyết gắn kết bề mặt (sad ). Hai loại đột biến sad đã được phân tích: (i) đột biến có khiếm khuyết trong vận động do tiên mao điều khiển và (ii) đột biến có khiếm khuyết trong sinh tổng hợp các pili loại IV cực bộ. Chúng tôi đã theo dõi sự phát triển của màng sinh học được hình thành bởi chủng hoang dại trong hơn 8 giờ sử dụng kính hiển vi tương phản pha. Chủng hoang dại đầu tiên tạo thành một lớp đơn lẻ các tế bào trên bề mặt vô cơ, sau đó là sự xuất hiện của các tế bào vi khuẩn nhỏ phân tán khắp lớp đơn lẻ các tế bào này. Sử dụng kính hiển vi quay lại thời gian thực, chúng tôi cung cấp bằng chứng cho thấy các tế bào vi khuẩn nhỏ được hình thành bằng cách kết tụ các tế bào có mặt trong lớp đơn. Giống như đã quan sát ở chủng hoang dại, các chủng có đột biến trong gen cần thiết cho sự tổng hợp của pili loại IV hình thành một lớp đơn của các tế bào trên nhựa PVC. Tuy nhiên, khác với chủng hoang dại, các đột biến pili loại IV không phát triển các tế bào vi khuẩn nhỏ trong suốt quá trình thí nghiệm, cho thấy rằng những cấu trúc này đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các tế bào vi khuẩn nhỏ. Rất ít tế bào của chủng không có khả năng vận động (mang đột biến trong flgK ) bám vào PVC ngay cả sau 8 giờ ủ, gợi ý vai trò của tiên mao và/hoặc vận động trong tương tác ban đầu giữa tế bào và bề mặt. Kiểu hình của các đột biến này do đó cho phép chúng tôi bắt đầu trạng thái phân tích con đường phát triển dẫn đến hình thành màng sinh học.

Mặc dù đã có hơn một thế kỷ nghiên cứu, bệnh lao vẫn là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do nhiễm trùng trên toàn cầu. Trước tình trạng gia tăng tỷ lệ kháng thuốc, việc xác định các gen cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật này sẽ cung cấp các mục tiêu mới cho việc thiết kế các tác nhân kháng mycobacterium. Ở đây, chúng tôi mô tả việc sử dụng phương pháp lai ghép vị trí transposon (TraSH) để xác định một cách toàn diện các gen cần thiết cho tác nhân gây bệnh, Mycobacterium tuberculosis, nhằm đạt được sự phát triển tối ưu. Các gen này bao gồm những gen có thể được phân loại thành các con đường thiết yếu cũng như nhiều gen chưa được xác định chức năng. Các gen quan trọng cho sự phát triển của M. tuberculosis chủ yếu được bảo tồn trong bộ gen suy thoái của trực khuẩn phong, Mycobacterium leprae, cho thấy rằng các chức năng không thiết yếu đã bị mất chọn lọc kể từ khi vi khuẩn này phân nhánh ra khỏi những loài mycobacteria khác. Ngược lại, một tỷ lệ đáng ngạc nhiên của các gen này không có các đồng hình đã xác định trong các vi khuẩn khác, cho thấy rằng bộ gen tối thiểu cần thiết cho sự sống sót biến đổi rất lớn giữa các sinh vật có lịch sử tiến hóa khác nhau.

Quần thể vi sinh vật bám vào bề mặt, bao gồm một hoặc nhiều loài thường được gọi là màng sinh học. Sử dụng một phương pháp thử nghiệm đơn giản để khởi đầu hình thành màng sinh học (ví dụ: bám vào bề mặt không sinh học) của chủng Pseudomonas fluorescens WCS365, chúng tôi đã chỉ ra rằng: (i) P. fluorescens có thể hình thành màng sinh học trên một bề mặt không sinh học khi được nuôi trên một loạt các chất dinh dưỡng; (ii) sự tổng hợp protein là cần thiết cho các sự kiện ban đầu của quá trình hình thành màng sinh học; (iii) một (hoặc nhiều) protein ngoài bào tương đóng vai trò trong tương tác với bề mặt không sinh học; (iv) độ thẩm thấu của môi trường ảnh hưởng đến khả năng của tế bào trong việc hình thành màng sinh học. Chúng tôi đã phân lập các đột biến transposon bị khiếm khuyết trong việc khởi đầu hình thành màng sinh học, mà chúng tôi gọi là khiếm khuyết gắn bề mặt (sad). Phân tích phân tử của các đột biến sad cho thấy protein ClpP (một thành phần của protease Clp trong bào tương) tham gia vào quá trình hình thành màng sinh học ở sinh vật này. Phân tích gen của chúng tôi gợi ý rằng quá trình hình thành màng sinh học có thể tiến triển thông qua nhiều con đường tín hiệu hội tụ, được điều chỉnh bởi các tín hiệu môi trường khác nhau. Cuối cùng, trong 24 đột biến sad được phân tích trong nghiên cứu này, chỉ có ba đột biến có khiếm khuyết ở các gen có chức năng đã biết. Kết quả này cho thấy rằng nghiên cứu của chúng tôi đang khám phá các khía cạnh mới của sinh lý vi khuẩn.

Các chủng Escherichia coli gây bệnh gây ra hơn 160 triệu ca tiêu chảy và một triệu ca tử vong mỗi năm, trong khi các chủng E. coli không gây bệnh là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường ở các động vật có vú và chim khỏe mạnh. Các con đường tiến hóa dẫn đến sự phân biệt ở lối sống vi khuẩn này đã được nghiên cứu thông qua phân loại trình tự đa locus của bộ sưu tập toàn cầu các chủng. Các loại tác nhân gây bệnh cụ thể [E. coli gây chảy máu, E. coli gây bệnh đường ruột, E. coli xâm nhập, K1 và Shigella] đã xuất hiện độc lập và lặp đi lặp lại trong nhiều nhánh khác nhau, trong khi một số nhánh khác chỉ chứa rất ít tác nhân gây bệnh. Tốc độ tiến hóa đã tăng tốc ở các nhánh gây bệnh, đạt đỉnh điểm ở các vi sinh vật có độc lực cao mà nội dung gen của chúng thường xuyên thay đổi do tăng tốc độ tái tổ hợp đồng gen; do đó, sự tiến hóa của độc lực có liên quan đến giới tính vi khuẩn. Mô hình tiến hóa lâu dài này đã được quan sát ở các gen phân bố khắp toàn bộ hệ gen, và do đó có khả năng là kết quả của sự chọn lọc theo từng đợt cho các dòng có khả năng thoát khỏi phản ứng miễn dịch của ký chủ.

Sự phát triển gần đây của các vector và phương pháp để đưa DNA tái tổ hợp vào các thành viên của chi Mycobacterium đã cung cấp những cách tiếp cận mới để nghiên cứu những vi khuẩn quan trọng này. Trong khi hầu hết các chủng mycobacteria gây bệnh phát triển chậm, Mycobacterium smegmatis là một loài phát triển nhanh và không gây bệnh, đã được sử dụng trong nhiều năm như một vật chủ cho sự phát triển của mycobacteriophage và, gần đây, như một vật chủ cho việc giới thiệu DNA tái tổ hợp. Việc sử dụng nó như một vật chủ sao chép để phân tích các gen mycobacteria đã bị hạn chế bởi khả năng chuyển đổi plasmid không hiệu quả. Công trình này mô tả việc tách biệt và đặc trưng hóa các đột biến của M. smegmatis có thể được chuyển đổi, sử dụng phương pháp điện chuyển, với hiệu suất cao gấp 10⁴ đến 10⁵ lần so với chủng gốc, tạo ra hơn 10⁵ biến thể mỗi μg DNA plasmid. Các đột biến mang lại tính trạng chuyển đổi plasmid hiệu quả (Ept) này không làm ảnh hưởng đến sự tiêm chuyển phage hoặc sự tích hợp DNA vào nhiễm sắc thể M. smegmatis, nhưng dường như chỉ đặc hiệu cho chuyển đổi plasmid. Những đột biến Ept như vậy đã được sử dụng để xác định các nucleotide DNA plasmid cần thiết cho sự sao chép của plasmid Mycobacterium fortuitum pAL5000 trong mycobacteria bằng cách cho phép chuyển đổi một thư viện các cấu trúc hybrid plasmid. Việc chuyển đổi plasmid hiệu quả ở M. smegmatis sẽ tạo điều kiện cho việc phân tích chức năng, biểu hiện và sự sao chép của gen mycobacterial, từ đó hỗ trợ phát triển BCG như một vector vắc xin tái tổ hợp đa trị và trong phân tích di truyền các yếu tố gây virulence của mycobacteria gây bệnh.

Màng ngoài bảo vệ vi khuẩn Gram âm khỏi môi trường khắc nghiệt. Đồng thời, các protein nhúng trong màng thực hiện nhiều nhiệm vụ quan trọng đối với tế bào vi khuẩn, chẳng hạn như chuyển vị chất và protein, cũng như truyền dẫn tín hiệu. Không giống như các protein màng từ tất cả các nguồn khác, protein màng ngoài tích hợp không bao gồm các α-helix xuyên màng, mà thay vào đó gấp lại thành các cấu trúc β-barrel ngược chiều. Trong những năm gần đây, cấu trúc nguyên tử của một số protein màng ngoài đã được xác định, thuộc về sáu họ khác nhau. Chúng bao gồm miền màng OmpA, protein OmpX, phospholipase A, các porin tổng quát (OmpF, PhoE), các porin đặc hiệu với chất nền (LamB, ScrY) và các vận chuyển siderophore sắt phụ thuộc TonB FhuA và FepA. Những nghiên cứu tinh thể học này đã mang lại cái nhìn quý giá và thúc đẩy việc hiểu biết về chức năng của những protein thú vị này. Bài đánh giá của chúng tôi nhằm thảo luận về các nguyên tắc chung và những điểm đặc biệt cũng như các câu hỏi còn bỏ ngỏ liên quan đến chúng.

Các gen độc lực của vi khuẩn gây bệnh, chịu trách nhiệm mã hóa cho toxin, adhesin, invasin hoặc các yếu tố độc lực khác, có thể nằm trên các yếu tố di truyền có thể truyền (transmissible genetic elements) như transposon, plasmid hoặc bacteriophage. Ngoài ra, các gen này có thể là một phần của những vùng đặc biệt trên nhiễm sắc thể vi khuẩn, được gọi là 'các đảo độc lực' (pathogenicity islands - Pais). Các đảo độc lực được tìm thấy ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Chúng có mặt trong bộ gen của các chủng gây bệnh của một loài nhất định nhưng vắng mặt hoặc chỉ hiếm khi có mặt ở những biến thể không gây bệnh của loài đó hoặc các loài liên quan. Chúng bao gồm các vùng DNA lớn (lên tới 200 kb DNA) và thường mang nhiều hơn một gen độc lực, tỷ lệ G+C của chúng thường khác với phần còn lại của bộ gen vi khuẩn. Trong hầu hết các trường hợp, Pais được bao quanh bởi các trình tự DNA đặc hiệu, chẳng hạn như các lặp lại trực tiếp hoặc các yếu tố trình tự chèn (insertion sequence - IS). Thêm vào đó, Pais của một số vi khuẩn (ví dụ: vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu Escherichia coli, Yersinia spp., Helicobacter pylori) có xu hướng xóa bỏ với tần suất cao hoặc có thể trải qua sự nhân đôi và khuếch đại. Các Pais thường liên quan đến các vị trí tRNA, có thể đại diện cho các địa điểm mục tiêu cho sự tích hợp nhiễm sắc thể của các yếu tố này. Các vị trí gắn kết của bacteriophage và các gen ẩn (cryptic genes) trên Pais, có tính đồng hình với các gen integrase phage, các nguồn gốc sao chép plasmid hoặc các yếu tố IS, cho thấy rằng các yếu tố di truyền đặc biệt này trước đây có khả năng lây lan trong các quần thể vi khuẩn thông qua sự chuyển giao gen ngang (horizontal gene transfer), một quá trình được biết đến là có góp phần vào sự tiến hóa của vi sinh vật.

Nhiều vi khuẩn điều chỉnh biểu hiện gen theo mật độ quần thể tế bào, và hiện tượng này được gọi là cảm nhận mật độ quần thể. Ở vi khuẩn Gram âm, cảm nhận mật độ quần thể thường liên quan đến việc sản xuất, giải phóng và phát hiện các phân tử tín hiệu homoserin lactone đã được acyl hóa gọi là autoinducers. Vibrio harveyi, một loại vi khuẩn biển phát quang Gram âm, điều chỉnh sản xuất ánh sáng phản ứng với hai autoinducers khác nhau (AI‐1 và AI‐2). AI‐1 là một homoserin lactone. Cấu trúc của AI‐2 chưa được biết đến. Chúng tôi đã đề xuất trước đây rằng V. harveyi sử dụng AI‐1 cho giao tiếp trong loài và AI‐2 cho giao tiếp giữa các loài. Nhất quán với ý tưởng này, chúng tôi đã chỉ ra rằng nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương sản xuất AI‐2 và, trong mọi trường hợp, việc sản xuất AI‐2 phụ thuộc vào chức năng được mã hóa bởi gen luxS. Chúng tôi ở đây chứng minh rằng LuxS là enzyme tổng hợp AI‐2 và rằng AI‐2 được sản xuất từ S‐adenosylmethionine qua ba bước enzym. Substrate cho LuxS là S‐ribosylhomocysteine, được cắt để tạo thành hai sản phẩm, một trong số đó là homocysteine, và sản phẩm còn lại là AI‐2. Trong báo cáo này, chúng tôi cũng cung cấp bằng chứng rằng con đường tổng hợp và các chất trung gian sinh hóa trong tổng hợp AI‐2 là giống nhau ở Escherichia coli, Salmonella typhimurium, V. harveyi, Vibrio cholerae và Enterococcus faecalis. Kết quả này gợi ý rằng, không giống như cảm nhận mật độ quần thể thông qua nhóm các autoinducers homoserin lactone liên quan, AI‐2 là một tín hiệu độc đáo, ‘vũ trụ’ có thể được sử dụng bởi nhiều loại vi khuẩn để giao tiếp giữa và trong các loài.

Sự hình thành biofilm bởi biến dạng hoang dã Pseudomonas aeruginosa PAO1 được gắn nhãn Gfp, các đột biến roi và loại IV pili trong các buồng chảy được tưới bằng môi trường tối thiểu citrat đã được đặc trưng nhờ việc sử dụng kính hiển vi quét laser đồng tiêu và phân tích hình ảnh comstat. Roi và pili loại IV không cần thiết cho việc bám đầu tiên hay hình thành biofilm của P. aeruginosa, tuy nhiên các phụ kiện tế bào có vai trò trong sự phát triển của biofilm, vì dạng hoang dã, roi và pili loại IV đã hình thành biofilm với các cấu trúc khác nhau. Động lực học và sự lựa chọn trong quá trình hình thành biofilm đã được điều tra bằng cách gắn nhãn dạng hoang dã và các đột biến roi/loại IV bằng Yfp và Cfp và thực hiện kính hiển vi quét laser đồng tiêu theo chuỗi hình ảnh thời gian trong các biofilm màu hỗn hợp. Sự hình thành vi khuẩn ban đầu diễn ra bằng cách phát triển vô tính, sau đó vi khuẩn P. aeruginosa dạng hoang dã lan rộng trên bề mặt nhờ sự vận động co giật. Biofilm dạng hoang dã là những cấu trúc động với sự vận động, cạnh tranh và chọn lọc mở rộng đang diễn ra trong quá trình phát triển. Di cư của vi khuẩn ngăn chặn sự hình thành các cấu trúc vi khuẩn lớn hơn trong biofilm dạng hoang dã. Kết quả được thảo luận liên quan đến mô hình hiện tại về sự phát triển biofilm của P. aeruginosa.

Sự bám dính của các tế bào máu đỏ nhiễm (iRBC) được trung gian hóa thông qua các kháng nguyên bề mặt biến thể clonally (VSA) do ký sinh trùng mã hóa và là một quá trình trung tâm trong sinh bệnh học của sốt rét Plasmodium falciparum. Sốt rét liên quan đến thai kỳ (PAM) đã được liên kết với sự bám dính của iRBC nhờ vào VSA tới glycosaminoglycan chondroitin sulfat A (CSA) trong không gian gian bào nhau thai. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành viên của gia đình VSA PfEMP1 đóng vai trò trung gian trong việc cản trở iRBC đặc hiệu CSA tại nhau thai. Tại đây, chúng tôi báo cáo sự gia tăng đáng kể của một gen var duy nhất trong nhiều chủng ký sinh trùng P. falciparum sau khi lựa chọn cho sự bám dính vào CSA in vitro. Gen này thuộc về một tiểu họ gen var rất bảo tồn và phổ biến (var2csa). Các gen var2csa có cấu trúc khác biệt so với tất cả các gen var khác trong bộ gen ký sinh trùng do thiếu cả miền CIDR và miền DBL‐γ. Những vùng này trước đây đã được chứng minh có liên quan đến sự bám dính trung gian PfEMP1 tới CD36 và CSA. Chúng tôi cũng cho thấy rằng var2csa đã được phiên mã với mức độ cao hơn ở ba mẫu ký sinh trùng nhau thai so với sự phiên mã ở các ký sinh trùng từ máu ngoại vi của hai trẻ em mắc sốt rét P. falciparum. Do đó, gen var này có các đặc tính như mong đợi của một gen mã hóa phân tử bám dính ký sinh trùng khởi đầu cho bệnh lý liên quan đến PAM.