Molecular Microbiology

Yersinia ngoại bào bám vào bề mặt của một tế bào eukaryotic đã chuyển vị hiệu ứng Yops qua màng bào tương của tế bào bằng một cơ chế yêu cầu YopD và YopB, trong đó YopB có thể thúc đẩy quá trình hình thành lỗ. Chúng tôi đã nghiên cứu vai trò của SycD, chaperone nội bào của YopD. Bằng cách sản xuất các protein lai GST–YopB và SycD trong Escherichia coli, chúng tôi nhận thấy rằng SycD cũng liên kết đặc hiệu với YopB và rằng việc liên kết này làm giảm độc tính của GST–YopB trong E. coli. Thông qua phân tích một loạt các protein GST–YopB bị cắt ngắn, chúng tôi nhận thấy rằng SycD không liên kết với một đoạn xác định của YopB. Sử dụng phương pháp tương tự, chúng tôi nhận thấy rằng YopD cũng có thể liên kết với YopB. Sự liên kết giữa YopB và YopD xảy ra ngay cả khi có sự hiện diện của SycD, và một phức hợp gồm ba protein này có thể được miễn dịch tách ra từ bào tương của Yersinia. Trong một biến thể sycD, lượng YopB và YopD trong tế bào giảm đáng kể trừ khi gen lcrV cũng bị xóa bỏ. Bởi vì LcrV được biết đến là tương tác với YopB và YopD và thúc đẩy sự tiết của chúng, chúng tôi suy đoán rằng SycD ngăn chặn sự kết hợp sớm giữa YopB–YopD và LcrV.

Salmonella typhimurium, loại vi khuẩn gây ra viêm dạ dày ruột ở bê con và con người cũng như một bệnh giống như thương hàn ở chuột, sử dụng nhiều yếu tố virulence để nhiễm vào vật chủ. Các gen mã hóa cho những yếu tố này được điều chỉnh bởi nhiều điều kiện môi trường và con đường điều hòa in vitro. Nhiều gen virulence được kích thích đặc biệt tại các vị trí cụ thể trong quá trình nhiễm bệnh hoặc trong các tế bào chủ được nuôi cấy. Sự điều chỉnh phức tạp của các gen virulence quan sát được in vitro có thể cần thiết để giới hạn biểu hiện của chúng tại các vị trí nhất định trong vật chủ. Các nghiên cứu in vitro và in vivo cung cấp manh mối về cách các gen virulence có thể được điều chỉnh in vivo. Các nghiên cứu trong tương lai phải đánh giá các tín hiệu môi trường thực tế và các yếu tố điều chỉnh điều chỉnh từng gen virulence in vivo và xác định cách mà nhiều con đường điều chỉnh được tích hợp để phối hợp biểu hiện thích hợp của các yếu tố virulence tại các vị trí cụ thể in vivo.

Pili là cần thiết cho việc chuyển giao protein và/hoặc ADN từ vi khuẩn sang tế bào cây nhận hoặc tế bào vi khuẩn, dựa trên bằng chứng di truyền. Tuy nhiên, chưa từng có bằng chứng trực tiếp cho thấy rằng các protein hiệu ứng hoặc ADN được định vị dọc theo hoặc bên trong các pili in situ. Việc không thể nhìn thấy mối liên hệ giữa các protein hiệu ứng/ADN với pili là vấn đề chính trong cuộc tranh luận về chức năng chính xác của pili trong việc chuyển giao protein và ADN. Trong nghiên cứu này, một quy trình gắn nhãn thần kinh miễn dịch in situ mới được phát triển đã cho phép hình ảnh hóa sự định vị cụ thể của các protein hiệu ứng loại III của Erwinia amylovora và Pseudomonas syringae pv. tomato dọc theo pili Hrp, nhưng không dọc theo roi hoặc phân tán ngẫu nhiên trong không gian giữa các tế bào. Ngược lại, PelE, một pectate lyase được tiết ra qua hệ thống tiết protein loại II, không liên quan đến pili Hrp. Các kết quả này cung cấp bằng chứng trực tiếp rằng sự tiết loại III chỉ xảy ra tại vị trí lắp ráp pili Hrp và rằng pili Hrp dẫn dắt quá trình chuyển giao protein hiệu ứng ra ngoài tế bào vi khuẩn, ủng hộ mô hình ‘kênh/lõi dẫn’.”

Hệ thống tiết protein kiểu III Hrp là yếu tố cần thiết cho khả năng gây bệnh của mầm bệnh thực vật Gram âm Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Sự biểu hiện của cụm gen hrp được điều khiển bởi HrpG, một bộ điều chỉnh phản hồi hai thành phần, và HrpX, một chất kích hoạt phiên mã kiểu AraC. Sử dụng kỹ thuật cDNA-AFLP, 30 đoạn cDNA được kích thích bởi hrpG (hgi) và năm đoạn cDNA chịu áp lực bởi hrpG (hgr) đã được xác định, cấu định một regulon hrpG lớn trong X. campestris pv. vesicatoria. Sự biểu hiện của hầu hết các gen trong regulon hrpG phụ thuộc vào hrpX. Bảy đoạn cDNA ảnh hưởng đến cụm gen hrp đã biết và các vùng lân cận. Tất cả các gen khác có vẻ như được phân bố trên nhiễm sắc thể và plasmid bản địa. Phân tích trình tự đã xác định được các gen mã hóa cho các protease ngoại bào dự kiến, một bộ điều chỉnh phiên mã dự kiến và XopJ và XopB (Xanthomonas protein ngoại vi), là đồng dạng của YopJ từ các loài Yersinia và protein bất khả năng gây bệnh AvrPphD của Pseudomonas syringae tương ứng. XopB được tiết ra bởi hệ thống tiết kiểu III Hrp. Phân tích các đột biến xóa trong một số gen hgi đã tiết lộ một locus virulence mới. Nghiên cứu này cho thấy rằng cDNA-AFLP là một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu transcriptome prokaryote và xác định các gen cung cấp khả năng gây bệnh cho Xanthomonas và các protein tác động dự kiến.

Khả năng tương tác của Salmonella typhimurium với tế bào chủ chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của hệ thống tiết protein loại III được mã hóa tại centisome 63 của nhiễm sắc thể của nó. Chúng tôi đã chỉ ra rằng hai mục tiêu của hệ thống tiết protein này, SipB và SipC, được chuyển vị vào các tế bào Henle-407 được nuôi cấy trong ruột. Quá trình chuyển vị yêu cầu chức năng của thiết bị tiết loại III, vì một dòng S. typhimurium mang đột biến ở invA, mã hóa một thành phần thiết yếu của hệ thống này, đã không chuyển vị được các protein Sip. Những đột biến không có mặt trong các gen mã hóa SipB, SipC hoặc SipD đã ngăn cản quá trình chuyển vị protein, cho thấy rằng các protein này tham gia vào quá trình chuyển vị. Ngược lại, những đột biến trong sipA và sptP, cũng mã hóa các protein được tiết ra, đã không can thiệp vào quá trình chuyển vị của SipC, cho thấy chỉ một tập hợp con các mục tiêu của hệ thống tiết loại III hoạt động như các translocase. Vi khuẩn được định vị bên ngoài hoặc bên trong có thể chỉ đạo quá trình chuyển vị protein vào các tế bào Henle-407 nếu vì quá trình này xảy ra trong sự hiện diện của cytochalasin D với nồng độ mà ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn, hoặc trong sự hiện diện của gentamicin được thêm vào ngay sau khi nội hóa vi khuẩn với nồng độ làm chết các Salmonella ngoài tế bào. Những kết quả này chỉ ra rằng việc chuyển vị protein vào tế bào chủ có thể là một chức năng phổ quát của tất cả các hệ thống tiết loại III.

Một sự kiện sớm trong nhiễm trùng Salmonella là sự xâm nhập của các tế bào biểu mô ruột không thực bào. Đạo bệnh được tiếp nhận thông qua quá trình macropinocytosis, được gây ra bởi việc truyền tải protein vi khuẩn phụ thuộc vào tiếp xúc, làm rối loạn các đường truyền tín hiệu và thúc đẩy sự tái sắp xếp cytoskeleton. SipB, một protein của Salmonella cần thiết cho việc truyền tải và xâm nhập, đã được chứng minh là định vị trên bề mặt tế bào của vi khuẩn xâm nhập vào các tế bào mục tiêu động vật có vú và phân đoạn với các protein màng ngoài. Để nghiên cứu các tính chất của SipB, chúng tôi đã tinh chế protein đầy đủ tự nhiên sau khi biểu hiện trong Escherichia coli tái tổ hợp. SipB tinh chế đã tụ hợp thành các hexamer thông qua một miền kháng protease ở đầu N được dự đoán sẽ hình thành một coiled coil dạng trimer, gợi nhớ đến các protein màng virus điều hướng sự kết hợp màng đồng loại. Protein SipB đã tích hợp vào cả màng tế bào động vật có vú và các túi phospholipid mà không làm ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của lớp lipid đôi, và nó đã thúc đẩy sự kết hợp liposome đạt tối ưu ở pH trung tính và bị ảnh hưởng bởi thành phần lipid màng. SipB đã chỉ đạo sự kết hợp dị loại, cho phép việc truyền tải nội dung từ các liposome xuất phát từ E. coli vào bào tương của các tế bào động vật có vú sống.

Chủng Pseudomonas aeruginosa gây bệnh xơ nang CHA gây ra hiện tượng oncosis ở bạch cầu trung tính và đại thực bào bằng cách phụ thuộc vào hệ thống tiết loại III nhưng không phụ thuộc vào ExoU. Kính hiển vi thời gian thực trong quá trình nhiễm trùng cho thấy sự tích tụ nhanh chóng của các vi khuẩn di động xung quanh các tế bào nhiễm đang trải qua hiện tượng oncosis, một hiện tượng chúng tôi đặt tên là 'pack swarming'. Việc đặc trưng hóa đột biến CHAcheZ không có hóa hướng động cho thấy 'pack swarming' là một phản ứng hóa hướng động của vi khuẩn đối với các đại thực bào bị nhiễm. Một biến thể không độc tế bào, thiếu các protein được tiết ra từ hệ thống loại III PcrV, PopB và PopD, chỉ có thể thực hiện 'pack swarm' trong sự hiện diện của chủng cha CHA hoặc khi các đại thực bào được điều trị trước bằng độc tố tạo lỗ streptolysin O. Sự tương tác của P. aeruginosa với hồng cầu (RBCs) cho thấy rằng sự hemolyse phụ thuộc vào tiếp xúc do CHA gây ra yêu cầu sự tiết ra qua hệ thống loại III và các protein PcrV, PopB/PopD. Kích thước lỗ được chèn vào màng RBC được ước tính từ các thí nghiệm bảo vệ thẩm thấu là từ 2.8 đến 3.5 nm. Các đại thực bào bị nhiễm CHA có thể được bảo vệ khỏi sự phân hủy tế bào bằng PEG3350, cho thấy rằng lỗ được đưa vào màng RBC và đại thực bào có kích thước tương tự. Quy trình tiếp nhận màu nhuộm huỳnh quang thiết yếu, Yo‐Pro‐1, vào các đại thực bào bị nhiễm đã xác nhận rằng sự hình thành các lỗ xuyên màng do CHA xảy ra trước khi tế bào trải qua hiện tượng oncosis. Do đó, cái chết của đại thực bào do CHA gây ra là kết quả của hoạt tính tạo lỗ phụ thuộc vào operon pcrGVHpopBD còn nguyên vẹn.

Động lực học phân tử của vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Yersinia pseudotuberculosis là một hệ thống mẫu được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế mà qua đó các tác nhân Gram âm tiết ra và sau đó chuyển giao các protein hiệu ứng chống cơ thể vào các tế bào eukaryotic mục tiêu thông qua một hệ thống tiết loại III chung (TTSS). Trong quá trình này, YopD (Yersiniaouter protein D) là yếu tố thiết yếu trong việc thiết lập kiểm soát quy định sự tổng hợp Yop và quá trình chuyển giao tiếp theo. Chức năng của YopD phụ thuộc vào chaperone LcrH của TTSS không tiết (low‐calcium response H), điều này là cần thiết cho việc ổn định YopD trước khi tiết ra. Tuy nhiên, do có một vai trò mới được đề xuất cho chaperone TTSS trong việc điều chỉnh gen gây virulence, chúng tôi đã tiến hành phân tích chi tiết về LcrH. Một đột biến lcrH không có khả năng sản xuất Yops liên tục, ngay cả khi chủng này được điều chỉnh để sản xuất các mức YopD giống như kiểu hoang dã. Hơn nữa, tương tác YopD–LcrH là cần thiết để phục hồi sự điều chỉnh âm của các gen liên quan đến virulence yops). Phát hiện này đã được sử dụng để điều tra ý nghĩa sinh học của một số đột biến LcrH với tiềm năng liên kết YopD khác nhau. Các alen LcrH bị đột biến đã được giới thiệu in trans vào một đột biến lcrH để đánh giá tác động của chúng đến việc điều chỉnh yop và quá trình chuyển giao tiếp theo của YopE, một protein hoạt hóa Rho‐GTPase, qua màng plasma của tế bào eukaryotic. Hai đột biến, LcrH_{K20E, E30G, I31V, M99V, D136G} và LcrH_E30G đã mất hoàn toàn khả năng điều chỉnh, mặc dù việc liên kết và tiết YopD và sự chuyển giao của YopE vẫn không khác biệt so với kiểu hoang dã. Hơn nữa, các đột biến thiếu khả năng điều chỉnh này cho thấy khả năng liên kết bị giảm với YscY trong thí nghiệm hai hybrid. Tóm lại, các phát hiện này xác nhận rằng LcrH đóng vai trò tích cực trong việc điều chỉnh yop, có thể được điều hòa thông qua một tương tác với thiết bị tiết Ysc. Sự tương tác giữa chaperone và cơ chất này tạo ra một phương thức sáng tạo để thiết lập thứ bậc điều chỉnh trong các trường hợp nhiễm Yersinia. Nó cũng đặt ra câu hỏi liệu LcrH có thực sự là một chaperone tham gia vào việc ổn định và tiết YopD hay là một protein điều chỉnh có trách nhiệm trong việc phối hợp tổng hợp các yếu tố gây virulence của Yersinia. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng LcrH có thể thể hiện cả hai hoạt động này.

Monophosphatase inositol (IMPases) là các enzyme nhạy cảm với lithium tham gia vào chu trình inositol của tín hiệu canxi và trong sinh tổng hợp inositol. Hai khung đọc mở (YHR046c và YDR287w) có độ tương đồng với IMPases ở động vật và thực vật tồn tại trong bộ gen nấm men. Hai protein tái tổ hợp tinh khiết này đã được chứng minh là xúc tác cho phản ứng thủy phân inositol-1-phosphate nhạy cảm với lithium và sodium. Việc đột biến cả hai gen không gây ra bất kỳ khiếm khuyết nào về tăng trưởng rõ rệt và không có biểu hiện phụ thuộc vào inositol. Do đó, tác động của lithium trên nấm men không thể được giải thích bằng cách ức chế IMPases và sự thiếu hụt inositol, như đã được gợi ý cho các hệ thống động vật. Sự biểu hiện quá mức của IMPases ở nấm men làm tăng độ dung nạp lithium và sodium đồng thời giảm sự tích tụ nội bào của lithium. Kiểu hình này đã bị chặn bởi một đột biến không có trong ATPase tống cation được mã hóa bởi gen ENA1/PMR2A, nhưng không bị ảnh hưởng bởi việc bổ sung inositol. Khi sự biểu hiện quá mức của IMPases gia tăng Ca²⁺ tự do nội bào, có thể nhận định rằng IMPases ở nấm men có giới hạn cho hoạt động tối ưu của chu trình inositol của tín hiệu canxi, điều này điều chỉnh ATPase tống cation Ena1.

Inositol monophosphatase đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp inositol de novo và trong con đường truyền tín hiệu thứ cấp phosphoinositide. Chúng tôi đã tách được khung đọc mở (ORF) YHR046c của Saccharomyces cerevisiae (được gọi là INM1), mã hóa inositol monophosphatase, xác định đặc điểm của protein Inm1p và phân tích sự biểu hiện của gen INM1. Gen INM1 được biểu hiện trong vi khuẩn dưới sự kiểm soát của promoter lacZ. Protein tinh khiết có hoạt động inositol monophosphatase bị ức chế bởi thuốc chống hưng cảm lithium, nhưng không bị ức chế bởi valproate. Trong đột biến inm1Δ::URA3 null, hoạt động inositol monophosphatase bị giảm nhưng không bị loại bỏ hoàn toàn. Sự gián đoạn này không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển trong điều kiện có lithium hoặc valproate và không ảnh hưởng đến sự phát triển trong điều kiện thiếu inositol. Để xác định sự điều chỉnh của INM1, chúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của inositol, nguồn carbon, giai đoạn tăng trưởng và các thuốc chống hưng cảm lithium và valproate lên sự biểu hiện của INM1 bằng cách sử dụng gen báo cáo INM1–lacZ. Không giống như tất cả các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp phospholipid khác đã được nghiên cứu, có chứa yếu tố điều chỉnh UAS_INO, sự biểu hiện của INM1 tăng lên khi có sự hiện diện của inositol. Ngoài ra, sự biểu hiện của INM1 bị ức chế trong quá trình phát triển với glycerol và được giải ức chế khi các tế bào được nuôi với glucose bước vào giai đoạn tĩnh. Cả lithium và valproate, gây giảm inositol nội bào, đều làm giảm sự biểu hiện của INM1. Một mô hình được trình bày để giải thích sự điều chỉnh sự biểu hiện của INM1.