Journal of Virology

Chúng tôi đã xây dựng một clone phân tử gây bệnh của retrovirus liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải. Sau khi chuyển gene, clone này đã chỉ đạo việc sản xuất các hạt virus gây bệnh trong nhiều loại tế bào khác nhau bên cạnh các tế bào T4 của người. Các virion gây bệnh được tổng hợp trong các dòng tế bào của chuột, chồn, khỉ và một số dòng tế bào không phải tế bào T của người, cho thấy không có bất kỳ trở ngại nội bào nào đối với việc sản xuất hoặc lắp ráp RNA virus hoặc protein. Trong quá trình nghiên cứu này, một dòng tế bào ung thư đại trực tràng người, rất nhạy cảm với việc chuyển gene DNA, đã được xác định.

Việc phát triển một loại vắc-xin hiệu quả chống virus suy giảm miễn dịch ở người loại 1 (HIV-1) có thể phụ thuộc vào kiến thức về các biến thể đang lưu hành của các gen khác ngoài các gen đã được giải trình tự phổ biến như gag và env . Hơn nữa, dữ liệu toàn bộ bộ gen hiện tại còn rất hạn chế đối với kiểu phân nhánh C của HIV-1, hiện đang là kiểu phân nhánh phổ biến nhất ở Ấn Độ và trên toàn thế giới. Tương tự, rất ít thông tin được biết đến về sự biến đổi trình tự của HIV-1 ở Ấn Độ, quốc gia đang phải đối mặt với gánh nặng HIV lớn nhất trên thế giới. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và đặc trưng hóa toàn bộ bộ gen của HIV-1 từ những người seroconverter bị nhiễm các biến thể kiểu phân nhánh C ở Ấn Độ. Các chủng HIV-1 đồng nuôi cấy được lấy từ sáu cá nhân có kết quả dương tính từ Pune, Ấn Độ và đã được khuếch đại, phân lập và giải trình tự bộ gen HIV-1 gần như đầy đủ từ mỗi mẫu. Phân tích trình tự cho thấy năm trong số sáu bộ gen thuộc kiểu phân nhánh C, trong khi một bộ gen là sự ghép nối của các kiểu phân nhánh A và C, với nhiều điểm gãy trong env , nef , và phần lặp dài cuối 3′ như được xác định bởi cả phân tích χ ² tối đa và bootstrap phân loại. Các trình tự đã được so sánh để bảo tồn các epitop tế bào T cytotoxic (CTL) đã biết. So với trình tự HIV-1 _LAI , 38% các epitop CTL đã được xác định rõ là giống nhau. Tỷ lệ các sự thay thế không bảo thủ cho Env, ở mức 61%, cao hơn ( P < 0.001) so với Gag (24%), Pol (18%) và Nef (32%). Do đó, những epitop CTL được đặc trưng cho thấy sự khác biệt đáng kể so với các chủng phòng thí nghiệm kiểu phân nhánh B, điều này rõ ràng nhất ở Env. Vì các dòng tế bào này được lấy từ những người seroconverter Ấn Độ, chúng có khả năng giúp thúc đẩy các nỗ lực liên quan đến vắc-xin ở Ấn Độ bằng cách cung cấp các kháng nguyên tiềm năng cho các ứng cử viên vắc-xin cũng như cho các thử nghiệm về khả năng đáp ứng với vắc-xin.

Dựa trên bằng chứng rằng 50% DNA herpes simplex 1 được phiên mã trong các tế bào HEp-2 trong điều kiện không có tổng hợp protein, chúng tôi đã khảo sát thứ tự và tỷ lệ tổng hợp các polypeptid virus trong các tế bào bị nhiễm sau khi đảo ngược sự ức chế tổng hợp protein do cycloheximide hoặc puromycin gây ra. Các thí nghiệm này cho thấy rằng các polypeptid virus hình thành ba nhóm được tổng hợp theo trình tự, được điều chỉnh đồng bộ được ký hiệu là α, β và γ. Cụ thể: (i) Nhóm α, bao gồm một polypeptid cấu trúc nhỏ và một số polypeptid không cấu trúc, được tổng hợp với tỷ lệ cao nhất từ 3 đến 4 giờ sau khi nhiễm trong các tế bào không điều trị và giảm dần sau đó. Nhóm β, cũng chứa các polypeptid cấu trúc nhỏ và không cấu trúc, được tổng hợp với tỷ lệ cao nhất từ 5 đến 7 giờ và giảm dần sau đó. Nhóm γ chứa các polypeptid cấu trúc chính được tổng hợp với tỷ lệ tăng cho đến ít nhất 12 giờ sau khi nhiễm. (ii) Sự tổng hợp các polypeptid α không cần tổng hợp protein tế bào bị nhiễm trước đó. Ngược lại, sự tổng hợp các polypeptid β yêu cầu cả sự tổng hợp polypeptid α trước đó cũng như tổng hợp RNA mới, vì việc thêm actinomycin D ngay sau khi loại bỏ cycloheximide đã ngăn cản sự tổng hợp polypeptid β. Chức năng do các polypeptid α cung cấp là ổn định vì sự gián đoạn tổng hợp protein sau khi bắt đầu tổng hợp polypeptid α và trước khi polypeptid β được tạo ra không ngăn cản sự tổng hợp ngay lập tức của các polypeptid β khi thuốc được rút lui. Yêu cầu tổng hợp các polypeptid γ cho sự tổng hợp trước đó của các polypeptid β dường như tương tự như yêu cầu của các polypeptid β cho sự tổng hợp trước đó của nhóm α. (iii) Tỷ lệ tổng hợp của các polypeptid α cao nhất ngay sau khi loại bỏ cycloheximide và giảm dần sau đó đồng thời với sự khởi đầu của tổng hợp polypeptid β; sự giảm này trong tổng hợp polypeptid α đã chậm hơn khi có mặt của actinomycin D, điều này ngăn cản sự xuất hiện của các polypeptid β và γ. Sự giảm tỷ lệ tổng hợp polypeptid β thường xảy ra sau 7 giờ sau khi nhiễm cũng chậm hơn khi có mặt của actinomycin D so với khi không có nó, trong khi tổng hợp polypeptid γ đang diễn ra vào thời điểm này đã bị giảm nhanh chóng bởi actinomycin D. (iv) Các chất ức chế tổng hợp DNA (cytosine arabinoside hoặc hydroxyurea) không ngăn cản sự tổng hợp các polypeptid α, β hay γ, nhưng đã giảm số lượng polypeptid γ được tạo ra.

Sự xâm nhập của virus corona được điều hòa bởi glycoprotein chóp (S) của virus. Protein S oligomer 180-kDa của virus corona chuột, chủng virus viêm gan chuột A59, được cắt xuyên dịch mã thành đơn vị liên kết thụ thể S1 và đơn vị hợp nhất màng S2. Đơn vị S2 được cho là chứa một peptide hợp nhất nội bộ và có hai vùng lặp hydrophobic 4,3 (heptad) được chỉ định là HR1 và HR2. HR2 nằm gần phần neo màng, trong khi HR1 cách đó khoảng 170 axit amin (aa). Các vùng lặp heptad (HR) được tìm thấy trong các protein hợp nhất của nhiều virus khác nhau và hình thành một đặc điểm quan trọng của các protein hợp nhất virus loại I. Chúng tôi đã điều tra vai trò của các vùng này trong quá trình hợp nhất màng của virus corona. Các peptide HR1 (96 aa) và HR2 (39 aa), tương ứng với các vùng HR1 và HR2, đã được sản xuất trong Escherichia coli. Khi được trộn lẫn, hai peptide này đã được tìm thấy tạo thành một phức hợp oligomer rất ổn định. Cả hai peptide, cả độc lập và trong phức hợp, đều có cấu trúc dạng xoắn alpha cao. Phân tích vi điện tử của phức hợp cho thấy một cấu trúc dạng que có chiều dài khoảng 14,5 nm. Phân giải protease giới hạn kết hợp với phổ khối cho thấy HR1 và HR2 xuất hiện trong phức hợp theo cách đối song song. Trong protein tự nhiên, cấu hình như vậy sẽ đưa peptide hợp nhất được đề xuất, nằm trong miền đầu N của HR1, và phần neo màng xuyên qua sự gần gũi. Sử dụng các thử nghiệm sinh học, peptide HR2 đã cho thấy là một chất ức chế mạnh mẽ quá trình xâm nhập virus vào tế bào, cũng như hợp nhất tế bào-tế bào. Dữ liệu sinh hóa và chức năng đều cho thấy protein chóp của virus corona là một protein hợp nhất virus loại I.

Các gen của virus papillomavirus người loại 16 tham gia trực tiếp vào quá trình chuyển hóa in vitro của tế bào keratinocyte người nguyên phát đã được xác định. Trong ngữ cảnh của toàn bộ bộ gen virus, sự đột biến trong khung đọc mở E6 hoặc E7 đã hoàn toàn làm mất khả năng chuyển hóa của những tế bào này. Ngược lại, sự đột biến trong khung đọc mở E1, E2 và E2-E4 không có tác động. Do đó, cả hai gen E6 và E7 phải có đủ cho sự kích thích sự bất tử của tế bào keratinocyte và khả năng kháng lại sự biệt hóa tận cùng. Các gen E6 và E7 được biểu hiện cùng nhau từ promoter beta-actin của người là đủ cho quá trình chuyển hóa này; sự đột biến của bất kỳ gen nào trong ngữ cảnh của plasmid tái tổ hợp này đã loại bỏ khả năng kích thích sự hình thành các biến thế kháng biệt hóa ổn định.

Comparative surface feature analyses of the VP1 sequences of hepatitis A virus (HAV) and poliovirus type 1 allowed an alignment of the two sequences and an identification of probable HAV neutralization antigenic sites. A synthetic peptide containing the HAV-specific amino acid sequence of one of these sites induced anti-HAV-neutralizing antibodies. It is concluded that a structural homology exists between the two viruses, despite minimal primary sequence conservation.

Ba mươi dòng hybridomas secreting immunoglobulin chống lại các kháng nguyên u bướu virus simian 40 đã được phân lập và nhân bản. Trong số đó, 28 dòng sản xuất kháng thể liên kết với antigen large-T của virus simian 40, và 2 dòng sản xuất kháng thể liên kết với protein 53,000 dalton của vật chủ. Như trong các công trình trước đây, antigen large-T được phát hiện có ít nhất một định nghĩa chung với antigen small-t và có tối thiểu sáu định nghĩa độc nhất. Một số kháng thể đơn dòng từ các dòng hybridoma loại L đã nhận diện các định nghĩa có mặt trên một tập hợp con của antigen large-T từ các tế bào chuột được chuyển hóa bởi virus simian 40. Các kháng thể đơn dòng này sẽ hữu ích trong các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các kháng nguyên u bướu virus simian 40.

Việc kích thích sản sinh các kháng thể trung hòa có hoạt tính chéo rộng rãi là một ưu tiên hàng đầu trong phát triển vắc xin AIDS, nhưng điều này đã chứng minh là rất khó đạt được. Trong khi hầu hết các chất gây miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa một phần các dòng virus HIV-1 đã thích nghi với dòng tế bào T, cho đến nay không có loại nào tạo ra phản ứng mạnh mẽ và có khả năng trung hòa rộng rãi đối với các mẫu virus nguyên phát. Ngay cả những cải tiến nhỏ trong việc tối ưu hóa chất gây miễn dịch dẫn đến gia tăng tỷ lệ kháng thể trung hòa và hoạt tính trung hòa chéo cũng sẽ thúc đẩy quá trình phát triển vắc xin; tuy nhiên, sự thiếu đồng nhất giữa các dòng mục tiêu được các nhà nghiên cứu khác nhau sử dụng để đánh giá tính trung hòa chéo đã gây khó khăn cho việc so sánh các phản ứng kháng thể do vắc xin tạo ra. Do đó, rất cần thiết để thiết lập các bảng tham chiếu chuẩn của các dòng HIV-1 để phân phối rộng rãi. Để hỗ trợ điều này, các gen gp160 có chiều dài đầy đủ đã được sao chép từ các ca nhiễm cấp tính và sớm thuộc subtype B và được đặc trưng để sử dụng làm thuốc tham khảo nhằm đánh giá kháng thể trung hòa đối với clade B HIV-1. Các dòng gp160 riêng lẻ đã được sàng lọc về khả năng lây nhiễm như các virus giả môi trường Env trong một bài kiểm tra gene báo cáo luciferase trong các tế bào JC53-BL (TZM-bl). Các dòngenvcó chức năng đã được giải trình tự và các kiểu hình trung hòa của chúng đã được xác định bằng cách sử dụng CD4 tan, kháng thể đơn dòng và mẫu huyết thanh từ những người bị nhiễm và những người không bị nhiễm đã nhận vắc xin gp120 tái tổ hợp. Các dòng Env từ 12 mẫu HIV-1 nguyên phát R5 đã được lựa chọn mà không quá nhạy cảm hoặc kháng cự bất thường với việc trung hòa và bao gồm một phổ rộng về tính đa dạng di truyền, kháng nguyên và địa lý. Những thuốc tham khảo này sẽ tạo điều kiện cho việc kiểm tra năng lực và các nỗ lực xác thực khác nhằm cải thiện hiệu suất phân tích giữa các phòng thí nghiệm và có thể được sử dụng để đánh giá chuẩn hóa các kháng thể trung hòa do vắc xin tạo ra.

Chúng tôi tiến hành một nghiên cứu phả hệ toàn diện để xác định mối quan hệ di truyền giữa các virus thuộc chi Flavivirus và so sánh phân loại dựa trên phả hệ phân tử với phương pháp huyết thanh học hiện nay. Bằng cách sử dụng sự kết hợp của các định nghĩa định lượng (mức độ hỗ trợ bootstrap và độ tương đồng trình tự nucleotide theo cặp), các virus có thể được phân loại thành các cụm, nhánh và loài. Nghiên cứu phả hệ của chúng tôi lần đầu tiên tiết lộ rằng từ tổ tiên giả thuyết, hai nhánh, cụm virus không véc-tơ và cụm virus truyền qua véc-tơ, đã tiến hóa và từ cụm sau đã xuất hiện các cụm virus truyền qua bọ ve và muỗi. Nếu giả thuyết về sự liên kết với các động vật chân đốt là một đặc điểm thu được là đúng, thì độ tương đồng trình tự nucleotide theo cặp giữa ba cụm này cung cấp dữ liệu hỗ trợ cho khả năng rằng cụm không véc-tơ tiến hóa trước tiên, tiếp theo là sự tách biệt giữa các cụm virus truyền qua bọ ve và muỗi theo thứ tự đó. Các nhánh được xác lập trong nghiên cứu của chúng tôi có mối tương quan đáng kể với các phức hợp kháng nguyên hiện có. Chúng tôi cũng đã giải quyết nhiều vấn đề phân loại trước đây bằng cách thiết lập mối quan hệ phả hệ của các virus không được phân loại kháng nguyên với các virus đã được xác định tốt và bằng cách xác định các virus đồng nghĩa.

Các quan sát di truyền và sinh học cho thấy lợn có thể đóng vai trò như "vật trung gian" cho sự hình thành các biến thể virus cúm A giữa người và chim, tương tự như những biến thể đã gây ra các đại dịch vào năm 1957 và 1968. Ở đây, chúng tôi chứng minh một cơ sở cấu trúc cho giả thuyết này. Các thụ thể bề mặt tế bào cho cả virus cúm ở người và virus cúm ở chim đã được xác định trong khí quản lợn, tạo ra một môi trường thuận lợi cho sự nhân bản và hoán đổi di truyền của virus. Thật ngạc nhiên, với sự nhân bản liên tục, một số virus cúm ở lợn giống chim đã có được khả năng nhận diện các thụ thể virus ở người, nâng cao khả năng chúng có thể truyền trực tiếp sang quần thể người. Những phát hiện này giúp giải thích sự xuất hiện của các virus cúm đại dịch và hỗ trợ cần thiết cho việc giám sát liên tục đối với lợn nhằm phát hiện các virus mang gen virus chim.