BMC Cell Biology

Apoptosis là một hình thức chết tế bào có lập trình được điều hòa bởi gia đình protein Bcl-2 và gia đình protein caspase. Đường truyền caspase chịu trách nhiệm thực hiện cái chết tế bào sau khi giải phóng cytochromec đã được mô tả rõ ràng; tuy nhiên, vai trò khác biệt của các caspase-9, -3 và -7 trong quá trình này vẫn chưa được xác định hoàn toàn.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh một số chức năng độc đáo cho mỗi caspase trong quá trình chết tế bào. Việc ức chế đặc hiệu caspase-9 cho phép giải phóng cytochromec một cách hiệu quả, nhưng ngăn cản sự thay đổi hình thái của ti thể và sản xuất ROS. Chúng tôi cho thấy rằng caspase-9 có thể cắt Bid thành tBid tại axit amin 59 và sự cắt này của Bid là cần thiết cho việc sản xuất ROS sau khi rút serum. Chúng tôi cũng chứng minh rằng các MEFs thiếu caspase-3 ít nhạy cảm hơn với kích thích cái chết tế bào nội tại, nhưng có sản xuất ROS cao hơn. Ngược lại, các MEFs thiếu caspase-7 không kháng lại cái chết tế bào nội tại, nhưng vẫn gắn kết với ECM.

Tổng hợp dữ liệu này cho thấy caspase-9 là cần thiết cho sự thay đổi hình thái ti thể và sản xuất ROS qua việc cắt và kích hoạt Bid thành tBid. Sau khi được kích hoạt bởi caspase-9, caspase-3 ức chế sản xuất ROS và là cần thiết cho việc thực hiện apoptosis một cách hiệu quả, trong khi caspase-7 hiệu ứng là cần thiết cho việc tách biệt tế bào apoptotic.

Một chủ đề nóng hổi trong điều trị y tế là sử dụng tế bào gốc trung mô (MSC) trong liệu pháp chữa bệnh. Tần suất thấp của phân nhóm tế bào gốc này trong tủy xương (BM) yêu cầu phải mở rộng nuôi cấy in vitro trước khi sử dụng lâm sàng. Chúng tôi đã đánh giá tác động của việc nuôi cấy dài hạn lên sự lão hóa của các tế bào này.

Thời gian nuôi cấy trung bình là 118 ngày và số lần chuyển dạng trung bình là 9. Số lượng PD trung bình giảm từ 7,7 xuống 1,2 ở lần chuyển dạng thứ 10. Độ dài telomere trung bình giảm từ 9,19 Kbp xuống 8,7 Kbp ở lần chuyển dạng thứ 9. Tiềm năng phân hóa giảm từ lần chuyển dạng thứ 6 trở đi. Các bất thường dạng hình của nuôi cấy là điển hình của mô hình lão hóa tế bào Hayflick.

Chúng tôi tin rằng MSC bắt đầu lão hóa gần như không thể phát hiện ngay từ thời điểm nuôi cấy in vitro. Đồng thời, các tế bào này cũng đang mất đi các đặc tính của tế bào gốc. Do đó, việc xem xét chúng cho liệu pháp tế bào và gene sớm là tốt hơn nhiều.

Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P ₂] là một phospholipid điều tiết hết sức quan trọng được tìm thấy trong màng plasma của tất cả các tế bào eukaryota. Ngoài việc là tiền chất của các thông điệp thứ cấp quan trọng, PtdIns(4,5)P ₂ còn điều tiết các kênh ion và các transporter, đồng thời phục vụ cho cơ chế nội bào bằng cách tuyển dụng các protein thích hợp clathrin. Việc hình ảnh hóa sự định vị và những thay đổi động lực học trong mức độ PtdIns(4,5)P ₂ trong tế bào sống là rất quan trọng để hiểu biết về sinh học của PtdIns(4,5)P ₂. Điều này chủ yếu đã được thực hiện bằng cách sử dụng miền pleckstrin homology (PH) của PLCδ1 nối với GFP. Tại đây, chúng tôi báo cáo một phân tích so sánh giữa một số miền PH nấm men được mô tả gần đây cũng như miền Tubby ở động vật có vú để đánh giá tính hữu dụng của chúng như các công cụ hình ảnh PtdIns(4,5)P ₂.

Tất cả các miền PH nấm men trước đây đã được chỉ ra là liên kết với PtdIns(4,5)P ₂ đều cho thấy sự định vị ở màng plasma nhưng chỉ một phần nhỏ phản ứng với các thao tác điều chỉnh PtdIns(4,5)P ₂ ở màng plasma. Không có miền nào trong số này thể hiện bất kỳ lợi thế nào so với reporter PLCδ1PH-GFP và đều bị ảnh hưởng bởi mức độ biểu hiện, định vị hạt nhân hoặc gây ra các cấu trúc màng đặc biệt. Ngược lại, miền Tubby cho thấy sự định vị ở màng cao, nhất quán với việc liên kết PtdIns(4,5)P ₂ và không hiển thị ái lực với headgroup hòa tan, Ins(1,4,5)P₃. So sánh chi tiết giữa miền Tubby và PLCδ1PH cho thấy miền Tubby có ái lực cao hơn đối với PtdIns(4,5)P ₂ màng và do đó thể hiện độ nhạy thấp hơn để báo cáo về những thay đổi của lipid này trong quá trình kích hoạt phospholipase C.

Các kết quả này cho thấy rằng cả PLCδ1PH-GFP và miền GFP-Tubby đều là các báo cáo hữu ích về những thay đổi của PtdIns(4,5)P ₂ ở màng plasma, với những lợi thế và nhược điểm rõ ràng. Trong khi PLCδ1PH-GFP là một báo cáo nhạy hơn, việc liên kết với Ins(1,4,5)P₃ của nó có thể làm giảm độ chính xác trong việc đo lường những thay đổi của PtdIns(4,5)P ₂. Miền Tubby thì chính xác hơn để báo cáo về PtdIns(4,5)P ₂ nhưng ái lực cao hơn và độ nhạy thấp hơn có thể hạn chế tính hữu dụng của nó khi kích hoạt phospholipase C chỉ ở mức vừa phải. Những nghiên cứu này cũng đã chứng minh rằng những thay đổi tương tự trong mức độ PtdIns(4,5)P ₂ ở màng plasma có thể điều chỉnh khác nhau nhiều hiệu ứng nếu chúng thể hiện các ái lực khác nhau với PtdIns(4,5)P ₂.

Các tế bào gốc trung mô (MSCs) có khả năng ứng dụng điều trị tiềm năng có thể cần phải mở rộng quy mô nuôi cấy in vitro trước khi cấy ghép. Các MSCs từ mô mỡ có thể được nuôi cấy mở rộng cho đến khi lão hóa. Tuy nhiên, vẫn còn rất ít thông tin về khả năng phân hóa của các tế bào gốc mỡ (ASCs) trong quá trình nuôi cấy kéo dài và các biến đổi dịch mã liên quan. Chúng tôi đã kiểm tra khả năng phân hóa thành mỡ của các dòng ASCs người trong nuôi cấy ở giai đoạn đầu và khi đến tuổi già, đồng thời xác định liệu sự lão hóa có liên quan đến các thay đổi trong methyl hóa DNA vùng khởi động adipogenic hay không.

Các dòng ASC được nuôi cấy đến tuổi già thể hiện khả năng phân hóa thành mỡ giảm trong điều kiện in vitro, dựa trên sự tổng hợp lipid hạn chế và giảm điều hòa gia tăng phiên mã của FABP4 và LPL, hai gen adipogenic, trong khi phiên mã của LEP và PPARG2 không bị ảnh hưởng. Trong các tế bào lão hóa không biệt hóa, biểu hiện của PPARG2 và LPL không thay đổi, trong khi mức độ bản sao của LEP và FABP4 tăng lên nhưng không ở tất cả các dòng. Phân tích trình tự bisulfite của methyl hóa DNA cho thấy mức độ ổn định tương đối của methyl hóa CpG ở vùng khởi động của LEP, PPARG2, FABP4 và LPL trong quá trình lão hóa và khi phân hóa. Sự phân mảng trong các hồ sơ methyl hóa được duy trì giữa và trong các dòng ASC, và bất kỳ thay đổi methyl hóa CpG cụ thể nào được phát hiện không nhất thiết phải liên quan đến khả năng phân hóa. Một ngoại lệ cho luận điểm này là CpG số 21 trong vùng khởi động LEP, sự methyl hóa liên quan đến lão hóa của nó có thể cản trở việc điều hòa gia tăng gen khi bị kích thích phân hóa thành mỡ.

Các ASC ở trạng thái lão hóa thể hiện khả năng phân hóa in vitro giảm và khả năng kích hoạt phiên mã của các gen adipogenic khi được kích thích phân hóa. Tuy nhiên, các hạn chế này không thể được quy cho các thay đổi cụ thể trong methyl hóa DNA ở các vùng khởi động adipogenic. Cũng dường như tồn tại một mối tương quan giữa các CpG bị hypo-methyl hóa và các vị trí liên kết của yếu tố phiên mã quan trọng.

Quá trình chuyển đổi biểu mô sang trung mô (EMT) liên quan đến yếu tố tăng trưởng biến đổi-β (TGF-β) là một sự kiện tế bào quan trọng trong quá trình hình thành cơ quan, ung thư và xơ hóa cơ quan. Quy trình đảo ngược EMT vẫn chưa được thiết lập rõ ràng. Mục đích của chúng tôi là xác định các con đường truyền tín hiệu và các yếu tố phiên mã duy trì trạng thái trung mô do TGF-β gây ra.

Các chất ức chế năm loại kinase có liên quan đến EMT, bao gồm kinase thụ thể TGF-β loại I (TβRI), kinase p38 MAPK, kinase kinase MAP/extracellular signal-regulated kinase activator kinase (MEK1), kinase c-Jun NH-terminal (JNK), và kinase Rho (ROCK), đã được đánh giá về khả năng đảo ngược trạng thái trung mô được gây ra trong các tế bào biểu mô ống thận. Các tác nhân đơn lẻ không hoàn toàn đảo ngược EMT như được xác định bởi hình thái tế bào và biểu hiện gen. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với chất ức chế TβRI SB431542, kết hợp với chất ức chế ROCK Y27632, đã loại bỏ các sợi căng stress actin có thể phát hiện và biểu hiện gen trung mô trong khi phục hồi biểu hiện E-cadherin và cadherin đặc hiệu thận (Ksp-cadherin). Một sự kết hợp thứ hai, chất ức chế TβRI SB431542 cùng với chất ức chế p38 MAPK SB203580, cũng có tác dụng một phần trong việc đảo ngược EMT. Hơn nữa, chất ức chế JNK SP600125 ức chế hiệu quả của chất ức chế TβRI SB431542 trong việc đảo ngược EMT. Để khám phá cơ sở phân tử dưới đây đảo ngược EMT, chúng tôi cũng đã nhắm đến các yếu tố ức chế phiên mã ZEB1 và ZEB2/SIP1. Giảm biểu hiện ZEB1 và ZEB2 trong các tế bào tuyến vú của chuột bằng shRNAs đã đủ để tăng cường biểu hiện của các protein biểu mô như E-cadherin và khôi phục các đặc điểm biểu mô. Tuy nhiên, việc phục hồi hoàn toàn cortical F-actin cần phải ủ với chất ức chế ROCK Y27632 kết hợp với sự gõ của ZEB1/2.

Sự di động của tế bào là một tham số quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý cũng như bệnh lý. Trong vi phim thời gian thực, việc theo dõi tế bào bằng tay vẫn là phương pháp phổ biến nhất để phân tích hành vi di cư của các quần thể tế bào. Ngoài việc mất nhiều công sức, phương pháp này còn dễ bị ảnh hưởng bởi các lỗi phụ thuộc vào người sử dụng liên quan đến việc chọn lựa các tập con "đại diện" của các tế bào và xác định vị trí tế bào một cách thủ công.

Chúng tôi đã phân tích định lượng các nguồn lỗi này, chứng minh rằng việc theo dõi tế bào bằng tay đối với tế bào ung thư tụy dẫn đến tính toán sai tỷ lệ di cư lên đến 410%. Để cung cấp các phép đo khách quan về tỷ lệ di cư của tế bào, chúng tôi đã sử dụng công nghệ theo dõi đa mục tiêu thường được sử dụng trong các ứng dụng radar để phát triển một hệ thống nhận diện và theo dõi tế bào hoàn toàn tự động phù hợp cho việc sàng lọc thông lượng cao các đoạn video của tế bào sống không nhuộm màu.

Màng lamina hạt nhân là một mạng lưới protein bên trong màng nhân, bao gồm polymer của các lamin hạt nhân liên kết với các protein xuyên màng của màng hạt nhân trong. Lamina có vai trò trong cấu trúc hạt nhân, biểu hiện gen và sự liên kết của bộ xương tế bào chất với hạt nhân. Chúng tôi đã xác định được một nhóm 67 protein xuyên màng của màng hạt nhân (NETs) tiềm năng mới trong một phân tích proteomics quy mô lớn. Do các đột biến trong các protein lamina đã được liên kết với một vài bệnh lý ở người ảnh hưởng đến cơ xương, chúng tôi đã xem xét biểu hiện của NET trong quá trình biệt hóa của các tế bào cơ myoblast C2C12. Mục tiêu của chúng tôi là xác định các thành phần mới của màng hạt nhân và lamina có biểu hiện đồng bộ với sự biệt hóa của cơ.

Bằng cách sử dụng phân tích microarray phiên mã, chúng tôi phát hiện rằng biểu hiện của 6 trong số các NET tăng lên đáng kể trong quá trình biệt hóa myoblast. Chúng tôi đã xác nhận những kết quả này bằng cách sử dụng RT-PCR định lượng, và hơn nữa, phát hiện rằng tất cả 6 NET đều được biểu hiện với mức độ cao ở cơ xương chuột trưởng thành so với 9 mô khác được kiểm tra. Sử dụng cDNA gắn thẻ epitop, chúng tôi đã xác định rằng 5 NET mà chúng tôi có thể phân tích (NETs 9, 25, 32, 37 và 39) đều nhắm đến màng hạt nhân trong các tế bào C2C12. Hơn nữa, 3 NET mà chúng tôi có thể phân tích bằng phương pháp blotting miễn dịch đã được làm giàu cao trong các màng hạt nhân so với màng vi hạt được tinh chế từ gan chuột. Các tìm kiếm cơ sở dữ liệu cho thấy 4 trong số 6 NET được tăng cường chứa các vùng đồng hình với các protein trước đây đã được liên kết với tín hiệu hóa.