DNA tổng hợp khác biệt như thế nào so với DNA tự nhiên?

DNA tự nhiên được sao chép và nhân đôi từ khuôn mẫu có sẵn trong tế bào sống, trong khi DNA tổng hợp được thiết kế trình tự theo dữ liệu số trên máy tính và tổng hợp de novo từng nucleotide đơn lẻ thông qua phản ứng hóa học hoặc xúc tác enzyme mà không cần khuôn mẫu tế bào.

Tại sao độ dài tổng hợp oligonucleotide trên cột hóa học thường bị giới hạn?

Hiệu suất ghép đôi mỗi chu kỳ photphoramidit đạt khoảng 99% đến 99,5%. Do sai số tích lũy nhân theo hàm mũ qua từng bước, các chuỗi dài hơn 150 đến 200 nucleotide có tỷ lệ sản phẩm lỗi và cắt cụt chiếm ưu thế, đòi hỏi chi phí tinh sạch và sửa lỗi rất cao.

DNA tổng hợp có tiềm năng ứng dụng gì trong lưu trữ dữ liệu số?

DNA sở hữu mật độ lưu trữ thông tin vật lý cực cao, đạt mức 5,5 petabit trên mỗi milimét khối (khoảng 700 terabyte trên mỗi gram vật liệu theo Church và cộng sự, 2012), cho phép mã hóa dữ liệu nhị phân thành các bazơ nitơ A, T, G, C để lưu trữ dữ liệu với dung lượng siêu đặc.

DNA tổng hợp (synthetic DNA) là gì?

Định nghĩa và bản chất sinh học

DNA tổng hợp (synthetic deoxyribonucleic acid) là các chuỗi phân tử axit deoxyribonucleic nhân tạo được tạo ra hoàn toàn bằng các phản ứng hóa học hoặc xúc tác enzyme in vitro mà không cần tế bào sống làm khuôn mẫu sinh học ban đầu. Không giống như DNA tự nhiên được chiết xuất từ tế bào vi sinh vật, thực vật hay động vật, phân tử DNA tổng hợp được lập trình tuần tự theo chuỗi nucleotide xác định trên máy tính, sau đó chế tạo trực tiếp từ các đơn phân hóa sinh độc lập.

Về mặt cấu trúc phân tử, DNA tổng hợp mang khung liên kết đường-phosphate tương đồng với DNA tự nhiên, gồm bốn loại đơn phân bazơ nitơ cơ bản là adenin, thymin, guanin và cytosin liên kết cộng hóa trị qua liên kết phosphodiester. Sự ra đời của công nghệ tổng hợp de novo đã chuyển đổi sinh học phân tử từ một ngành khoa học thuần túy mô tả và phân tích sang ngành kỹ thuật có khả năng thiết kế và tạo mới vật liệu di truyền theo nhu cầu.

Khác biệt cốt lõi giữa DNA tổng hợp và DNA tái tổ hợp nằm ở phương thức khởi sinh trình tự. DNA tái tổ hợp phụ thuộc vào việc cắt và nối các đoạn gen tự nhiên sẵn có nhờ enzyme giới hạn và ligase, trong khi DNA tổng hợp được xây dựng từng bước từ các phân tử tiền chất hóa học tự do. Khả năng thiết kế de novo cho phép các nhà khoa học loại bỏ hoàn toàn các trình tự không mong muốn, tối ưu hóa bộ ba mã hóa cho sinh vật chủ và tích hợp các chức năng sinh học phi tự nhiên.

Cơ chế tổng hợp de novo

Công nghệ chế tạo DNA tổng hợp phát triển qua hai phương thức chính bao gồm tổng hợp hóa học pha rắn và tổng hợp sinh học bằng xúc tác enzyme.

Hóa học photphoramidit trên cột pha rắn

Phương pháp tổng hợp oligonucleotide tiêu chuẩn trên cột pha rắn sử dụng hóa học photphoramidit (phosphoramidite chemistry) được phát triển và chuẩn hóa từ thập niên 1980. Quá trình tổng hợp diễn ra theo chiều từ đầu 3' đến đầu 5', ngược với chiều tự nhiên của enzyme DNA polymerase trong tế bào. Mỗi chu kỳ bổ sung một nucleotide đơn phân diễn ra qua bốn phản ứng hóa học kế tiếp nhau:

Khử bảo vệ (deprotection / detritylation): Loại bỏ nhóm bảo vệ trityl ở đầu 5' của nucleotide gắn trên giá thể rắn bằng dung dịch axit, giải phóng nhóm hydroxyl 5' tự do cho phản ứng kế tiếp.
Ghép đôi (coupling): Kích hoạt đơn phân photphoramidit mới bằng hợp chất tetrazole, tạo điều kiện cho nhóm hydroxyl 5' tấn công ái nhân vào nguyên tử phosphor, hình thành liên kết phosphite triester mới. Theo tổng quan của Kosuri và Church (2014), hiệu suất ghép đôi cho mỗi chu kỳ cộng đơn phân trên cột chuẩn đạt mức từ 99% đến 99,5%.
Đóng nắp (capping): Xử lý bề mặt phản ứng bằng hỗn hợp anhydride acetic để acetyl hóa các nhóm hydroxyl chưa tham gia phản ứng ghép đôi. Bước này vô hiệu hóa các chuỗi khiếm khuyết, ngăn chặn chúng tiếp tục kéo dài thành các chuỗi đột biến mất đoạn khó tinh sạch.
Oxy hóa (oxidation): Sử dụng dung dịch iod để chuyển đổi liên kết phosphite triester hóa trị ba kém bền thành liên kết phosphotriester hóa trị năm bền vững, hoàn tất chu kỳ cộng một đơn phân.

Do sai số tích lũy nhân lên qua từng chu kỳ phản ứng, theo tổng quan của Kosuri và Church (2014), độ dài tối đa của chuỗi oligonucleotide đơn tổng hợp trên cột thường bị giới hạn trong khoảng từ 150 đến 200 nucleotide nếu không qua các bước tinh sạch phức tạp.

Công nghệ vi mảng tổng hợp quy mô lớn

Để sản xuất thư viện oligonucleotide quy mô lớn phục vụ công nghệ sinh học, nền tảng vi mảng (microarray) cho phép tổng hợp đồng thời hàng trăm nghìn trình tự đơn song song trên bề mặt phẳng của một chip bán dẫn hoặc thủy tinh. Theo Kosuri và Church (2014), công nghệ vi mảng giúp giảm chi phí tổng hợp từ 2 đến 4 bậc độ lớn so với phương pháp tổng hợp trên cột riêng lẻ. Tuy nhiên, do thể tích phản ứng siêu nhỏ và ảnh hưởng biên bề mặt, tỷ lệ lỗi ở vi mảng theo Kosuri và Church (2014) thường dao động ở mức 1 đột biến trên 200 đến 500 cặp base, đòi hỏi các bước sửa sai bổ sung bằng enzyme endonuclease chuyên biệt trước khi lắp ráp thành chuỗi dài.

Tổng hợp de novo bằng enzyme

Để khắc phục nhược điểm tiêu thụ dung môi hữu cơ độc hại và giới hạn chiều dài của phương pháp hóa học photphoramidit, phương pháp tổng hợp de novo bằng enzyme đã được phát triển. Nghiên cứu của Palluk và cộng sự (2018) đã chứng minh khả năng sử dụng enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) tiếp hợp với nucleotide để kéo dài chuỗi DNA trong môi trường dung dịch nước. Enzyme TdT có khả năng gắn các nucleotide vào đầu 3' của đoạn mồi mà không cần khuôn mẫu DNA tự nhiên. Phương pháp enzyme hoạt động hoàn toàn trong điều kiện nước thân thiện với môi trường, mở ra triển vọng tổng hợp trực tiếp các đoạn phân tử dài hàng nghìn nucleotide với độ tinh sạch cao.

Mô hình định lượng hiệu suất tổng hợp

Hiệu suất tổng thể của quá trình tổng hợp chuỗi oligonucleotide phụ thuộc hàm mũ vào hiệu suất ghép đôi của từng chu kỳ hóa học. Mối quan hệ toán học giữa hiệu suất tổng hợp toàn phần, hiệu suất ghép đôi từng bước và độ dài chuỗi oligonucleotide được biểu diễn qua công thức:

Y = (C)^{n-1}

Trong đó, đại lượng $Y$ đại diện cho hiệu suất tổng hợp toàn phần của phân tử mục tiêu, đại lượng $C$ là hiệu suất ghép đôi từng bước cho mỗi nucleotide, và $n$ là tổng số nucleotide trong chuỗi oligonucleotide hoàn chỉnh. Theo mô hình này, một chuỗi gồm $n$ nucleotide đòi hỏi trải qua chính xác $n - 1$ chu kỳ ghép đôi tuần tự.

Khi chiều dài chuỗi đạt mức $n$ bằng 150 nucleotide với hiệu suất ghép đôi $C$ ở mức 99% (theo Kosuri và Church, 2014), tỷ lệ phân tử đích hoàn chỉnh nguyên vẹn thu được chỉ còn khoảng hơn hai mươi phần trăm tổng sản phẩm phản ứng thô. Phần còn lại chiếm đa số là các chuỗi phụ bị cắt cụt sinh ra do phản ứng đóng nắp ở từng chu kỳ. Điều này minh chứng tại sao việc nâng cao hiệu suất ghép đôi từ 99% lên 99,5% (theo Kosuri và Church, 2014) mang ý nghĩa quyết định đối với khả năng tổng hợp các chuỗi có độ dài lớn.

Lắp ráp hệ gen nhân tạo quy mô lớn

Để tạo ra các đại phân tử DNA dài hàng kilobase hoặc megabase như gen hoàn chỉnh và nhiễm sắc thể nhân tạo, các nhà khoa học áp dụng kỹ thuật lắp ráp phân tử từ nhiều đoạn cassette oligonucleotide ngắn được tổng hợp de novo. Hai cột mốc lịch sử tiêu biểu trong kỹ thuật lắp ráp hệ gen tổng hợp bao gồm:

Hệ gen vi khuẩn tổng hợp đầu tiên (JCVI-syn1.0): Năm 2010, Gibson và các cộng sự tại Viện J. Craig Venter đã công bố công trình lịch sử khi tổng hợp và lắp ráp thành công toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Mycoplasma mycoides mang mã hiệu JCVI-syn1.0 với kích thước 1,08 triệu cặp base. Toàn bộ hệ gen nhân tạo này được hợp nhất từ 1078 đoạn cassette DNA tổng hợp có chiều dài 1080 cặp base thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng từng bước trong tế bào nấm men. Hệ gen sau đó được cấy chuyển thành công vào tế bào nhận Mycoplasma capricolum, tạo ra tế bào sống đầu tiên chịu sự điều khiển hoàn toàn bởi hệ gen tổng hợp nhân tạo.
Hệ gen vi khuẩn tối thiểu (JCVI-syn3.0): Năm 2016, Hutchison và các cộng sự tiếp tục tối ưu hóa hệ gen tổng hợp để xác định tập hợp gen tối thiểu duy trì sự sống. Nhóm nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp hệ gen JCVI-syn3.0 chỉ gồm 473 gen với kích thước 531 nghìn cặp base, nhỏ hơn bất kỳ hệ gen tự nhiên nào của sinh vật tự sao chép từng được biết đến trong sinh giới.

Ứng dụng trong y sinh học và công nghệ

Công nghệ DNA tổng hợp mang lại những bước chuyển biến sâu sắc trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghiệp hiện đại:

Kỹ thuật chuyển hóa và sinh học tổng hợp: Cho phép thiết kế và đưa toàn bộ các cụm gen sinh tổng hợp nhân tạo vào vi sinh vật công nghiệp. Nhờ tổng hợp de novo các gen biến dưỡng đã được tối ưu hóa codon, các nhà nghiên cứu có thể sản xuất các hợp chất dược liệu phức tạp như tiền chất artemisinin trị sốt rét, axit sinh học và nhiên liệu tái tạo trong nấm men mà không phụ thuộc vào nguồn thảo dược tự nhiên.
Phát triển vắc-xin và liệu pháp sinh học: DNA tổng hợp đóng vai trò khuôn mẫu ban đầu quyết định tốc độ sản xuất vắc-xin thế hệ mới. Trong các đại dịch truyền nhiễm, khi giải mã được trình tự kháng nguyên virus, các nhà khoa học có thể tổng hợp chuỗi DNA khuôn mẫu chỉ trong vài ngày để sản xuất vắc-xin mRNA hoặc vắc-xin tái tổ hợp mà không cần phân lập trực tiếp mẫu virus sống từ ổ dịch.
Lưu trữ dữ liệu số: Nhờ mật độ lưu trữ vật lý cực cao và tính bền vững sinh hóa, DNA tổng hợp được phát triển thành phương tiện lưu trữ dữ liệu số trường tồn. Trong nghiên cứu của Church và cộng sự (2012), nhóm tác giả đã mã hóa thành công 5,27 megabit dữ liệu số vào 54898 đoạn oligonucleotide tổng hợp. Mỗi đoạn oligonucleotide hoàn chỉnh có chiều dài 159 nucleotide, bao gồm 115 nucleotide mang dữ liệu và địa chỉ chỉ mục cùng hai đoạn mồi 22 nucleotide ở hai đầu phục vụ phản ứng khuếch đại và giải trình tự đọc dữ liệu. Thí nghiệm của Church và cộng sự (2012) đã đạt mật độ lưu trữ thông tin vật lý lên tới 5,5 petabit trên mỗi milimét khối, tương đương khoảng 700 terabyte trên mỗi gram vật liệu DNA.

Hạn chế kỹ thuật và thách thức

Mặc dù đạt được những thành tựu vượt bậc, công nghệ DNA tổng hợp vẫn đối mặt với nhiều rào cản kỹ thuật và yêu cầu an toàn sinh học khắt khe:

Về mặt kỹ thuật, việc tổng hợp de novo các trình tự DNA có cấu trúc thứ cấp phức tạp, các vùng chứa nhiều đoạn lặp lại liên tiếp hoặc các đoạn có hàm lượng GC quá cao vẫn là thách thức lớn đối với cả phương pháp hóa học lẫn enzyme. Hiện tượng hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin) hoặc tự bắt cặp nội phân tử làm giảm mạnh hiệu suất phản ứng kéo dài chuỗi và gây khó khăn cho quá trình lắp ráp enzym in vitro.

Về mặt chi phí và sai số, chi phí tổng hợp trên cột chuẩn đối với các đoạn gen dài vẫn còn ở mức cao. Mặc dù công nghệ vi mảng mang lại chi phí thấp cho thư viện lớn, tỷ lệ đột biến điểm và mất đoạn đòi hỏi quy trình sàng lọc dòng vô tính và giải trình tự thế hệ mới ngặt nghèo để loại bỏ các biến thể lỗi trước khi ứng dụng vào hệ thống sinh học thực nghiệm.

Về mặt quản lý an toàn sinh học, khả năng tổng hợp de novo các đoạn vật liệu di truyền tiềm ẩn rủi ro lạm dụng để tạo ra các tác nhân gây bệnh nguy hiểm. Các tổ chức quốc tế và các nhà cung cấp dịch vụ tổng hợp gen toàn cầu đã thiết lập các quy chuẩn kiểm duyệt trình tự nghiêm ngặt, đối chiếu tự động mọi đơn hàng tổng hợp với cơ sở dữ liệu các gen độc tố và kháng nguyên nguy hại nhằm ngăn ngừa các nguy cơ an ninh sinh học.