Plant Methods

Protoplast thực vật, một hệ thống tế bào đã được chứng minh có tính sinh lý và linh hoạt, thường được sử dụng trong phân tích quy mô lớn và đặc trưng chức năng của các gen. Protoplast xanh đã được sử dụng thành công trong các nghiên cứu về con đường truyền tín hiệu thực vật liên quan đến hormone, chuyển hóa và thách thức môi trường. Ở cây lúa, protoplast thường được chuẩn bị từ các tế bào nuôi cấy dịch treo hoặc cây mầm bị ngạt, nhưng chỉ có một vài nghiên cứu khám phá việc sử dụng protoplast từ mô xanh của cây lúa.

Chúng tôi báo cáo một phương pháp đơn giản để tách protoplast từ mô xanh của cây lúa non được canh tác bình thường mà không cần hóa chất không cần thiết và thiết bị chân không. Việc chuyển gen cho protoplast được tạo ra với các plasmid có kích thước khác nhau (4.5-13 kb) và đồng chuyển gen với nhiều plasmid đạt được hiệu suất rất cao và cho phép đánh giá bằng 1) phân tích protein bằng kỹ thuật miễn dịch, 2) thử nghiệm định vị tế bào, và 3) phân tích tương tác protein-protein thông qua sự complementation huỳnh quang phân tử đôi (BiFC) và sự complementation luciferase đom đóm (FLC). Quan trọng là, protoplast từ mô xanh của lúa có hoạt tính quang hợp và nhạy cảm với chất kích thích tín hiệu plastid ngược dòng norflurazon (NF). Việc biểu hiện tạm thời yếu tố phiên mã liên quan đến ánh sáng đánh dấu GFP OsGLK1 đã tăng cường đáng kể mức độ bản sao của các gen quang hợp nội sinh OsLhcb1, OsLhcp, GADPH và RbcS, mà bị giảm phần nào do điều trị bằng NF ở protoplast từ mô xanh lúa.

Các xét nghiệm tạm thời sử dụng protoplasts là lý tưởng để xử lý một lượng lớn dữ liệu di truyền từ các xét nghiệm có độ cao. Trước đây, protoplasts đã được chuẩn bị thường xuyên từ mô dicot hoặc nuôi cấy tế bào lơ lửng, tuy nhiên một hệ thống tốt cho việc tách biệt và thao tác protoplasts từ lúa hiện vẫn thiếu sót.

Chúng tôi đã thiết lập một hệ thống protoplast từ mầm lúa được thiết kế cho việc định danh nhanh chóng số lượng lớn gen. Chúng tôi báo cáo các phương pháp tối ưu hóa để tách biệt protoplasts từ các mầm lúa già từ 7-14 ngày tuổi. Chúng tôi chỉ ra rằng các gen báo cáo luciferase GL2 và GUS đạt cực đại khoảng 20 giờ sau khi chuyển đổi vào protoplasts bằng polyethylene glycol (PEG). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất chuyển đổi thay đổi đáng kể tùy thuộc vào kích thước plasmid. Năm microgam plasmid 4.5 kb dẫn đến hiệu suất chuyển đổi 60-70%. Ngược lại, khi sử dụng 50 μg plasmid 12 kb, chúng tôi đạt tối đa 25-30% hiệu suất. Chúng tôi cũng chỉ ra rằng RNA can thiệp ngắn (siRNAs) có thể được sử dụng để làm tắt nhanh chóng và hiệu quả các gen ngoại lai. Một siRNA nhắm mục tiêu luciferase dẫn đến mức độ tắt đáng kể chỉ sau 3 giờ, và giảm đến 83% mức biểu hiện. Chúng tôi cũng đã tách biệt protoplasts từ các tế bào được chuẩn bị từ mô xanh hoàn toàn. Những protoplasts thu được từ mô xanh có thể được chuyển đổi để biểu hiện mức độ hoạt động luciferase cao và sẽ hữu ích cho việc kiểm tra các quá trình tế bào nhạy cảm với ánh sáng.

Chúng tôi báo cáo một hệ thống cho việc tách biệt, chuyển đổi và silencing gen của protoplasts được chiết xuất từ lá và thân lúa. Ngoài ra, chúng tôi đã mở rộng công nghệ đến các protoplasts được tách biệt từ mô xanh hoàn toàn. Hệ thống protoplasts sẽ nối kết khoảng cách giữa các xét nghiệm có độ cao và sinh học chức năng, vì nó có thể được sử dụng để nhanh chóng nghiên cứu một số lượng lớn gen có chức năng chưa được biết đến.

Phân tích khả năng sống sót thường được sử dụng như một phương tiện để so sánh hiệu suất của các dòng thực vật dưới điều kiện hạn hán. Tuy nhiên, việc đánh giá tình trạng nước của thực vật trong các nghiên cứu như vậy thường liên quan đến việc tách rời để ước lượng cú sốc nước, những phương pháp ước lượng không chính xác hoặc các phép đo xâm lấn như điều chỉnh thẩm thấu, ảnh hưởng đến hoặc hủy bỏ sự đánh giá tiếp theo về phản ứng của mẫu vật đối với hạn hán.

Bài báo này trình bày một quy trình để đánh giá nhanh chóng, giá rẻ và không xâm lấn khả năng sống sót của các cây trồng trên đất trong quá trình điều trị hạn hán. Những thay đổi trong các tham số quang hợp chính trong điều kiện thiếu nước ngày càng tăng đã được theo dõi thông qua hình ảnh huỳnh quang diệp lục và lựa chọn tham số hiệu suất tối đa của hệ thống quang hợp II (F_v/F_m) như một phương tiện đơn giản và thực tiễn nhất để theo dõi khả năng sống sót được mô tả. Tính hợp lệ của kỹ thuật này được xác minh thông qua ứng dụng với nhiều loại hình sinh thái và các dòng đột biến của Arabidopsis thaliana có khả năng chịu hạn thay đổi hoặc hiệu suất quang hợp giảm.

PCR phiên mã ngược định lượng – tổng hợp chuỗi polymerase (qRT-PCR) đã được chứng minh là đặc biệt phù hợp cho việc phân tích các gen được biểu hiện yếu, chẳng hạn như các gen mã hóa yếu tố phiên mã. Cây lúa (Oryza sativa L.) là một loại cây trồng quan trọng và là mô hình tiên tiến nhất cho các loài có một điểm mầm; bộ gen hạt nhân của nó đã được giải mã và các công cụ phân tử đang được phát triển cho các phân tích chức năng. Tuy nhiên, các phương pháp cao thông lượng cho nghiên cứu cây lúa vẫn còn hạn chế và một nền tảng qRT-PCR quy mô lớn cho phân tích biểu hiện gen chưa được báo cáo.