Một hệ thống mới để silencing gen sử dụng siRNAs trong protoplasts từ lá và thân lúa
Tóm tắt
Các xét nghiệm tạm thời sử dụng protoplasts là lý tưởng để xử lý một lượng lớn dữ liệu di truyền từ các xét nghiệm có độ cao. Trước đây, protoplasts đã được chuẩn bị thường xuyên từ mô dicot hoặc nuôi cấy tế bào lơ lửng, tuy nhiên một hệ thống tốt cho việc tách biệt và thao tác protoplasts từ lúa hiện vẫn thiếu sót.
Chúng tôi đã thiết lập một hệ thống protoplast từ mầm lúa được thiết kế cho việc định danh nhanh chóng số lượng lớn gen. Chúng tôi báo cáo các phương pháp tối ưu hóa để tách biệt protoplasts từ các mầm lúa già từ 7-14 ngày tuổi. Chúng tôi chỉ ra rằng các gen báo cáo luciferase GL2 và GUS đạt cực đại khoảng 20 giờ sau khi chuyển đổi vào protoplasts bằng polyethylene glycol (PEG). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất chuyển đổi thay đổi đáng kể tùy thuộc vào kích thước plasmid. Năm microgam plasmid 4.5 kb dẫn đến hiệu suất chuyển đổi 60-70%. Ngược lại, khi sử dụng 50 μg plasmid 12 kb, chúng tôi đạt tối đa 25-30% hiệu suất. Chúng tôi cũng chỉ ra rằng RNA can thiệp ngắn (siRNAs) có thể được sử dụng để làm tắt nhanh chóng và hiệu quả các gen ngoại lai. Một siRNA nhắm mục tiêu luciferase dẫn đến mức độ tắt đáng kể chỉ sau 3 giờ, và giảm đến 83% mức biểu hiện. Chúng tôi cũng đã tách biệt protoplasts từ các tế bào được chuẩn bị từ mô xanh hoàn toàn. Những protoplasts thu được từ mô xanh có thể được chuyển đổi để biểu hiện mức độ hoạt động luciferase cao và sẽ hữu ích cho việc kiểm tra các quá trình tế bào nhạy cảm với ánh sáng.
Chúng tôi báo cáo một hệ thống cho việc tách biệt, chuyển đổi và silencing gen của protoplasts được chiết xuất từ lá và thân lúa. Ngoài ra, chúng tôi đã mở rộng công nghệ đến các protoplasts được tách biệt từ mô xanh hoàn toàn. Hệ thống protoplasts sẽ nối kết khoảng cách giữa các xét nghiệm có độ cao và sinh học chức năng, vì nó có thể được sử dụng để nhanh chóng nghiên cứu một số lượng lớn gen có chức năng chưa được biết đến.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
De Sutter V, Vanderhaeghen R, Tilleman S, Lammertyn F, Vanhoutte I, Karimi M, Inze D, Goossens A, Hilson P: Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 2005, 44: 1065-1076.
Gregory DW, Cocking EC: The Large-Scale Isolation Of Protoplasts From Immature Tomato Fruit. J Cell Biol. 1965, 24: 143-146.
Asai T, Stone JM, Heard JE, Kovtun Y, Yorgey P, Sheen J, Ausubel FM: Fumonisin Bl-induced cell death in arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell. 2000, 12: 1823-1836.
Asai T, Tena G, Plotnikova J, Willmann MR, Chiu WL, Gomez-Gomez L, Boller T, Ausubel FM, Sheen J: MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 2002, 415: 977-983.
Hattori T, Terada T, Hamasuna S: Regulation of the Osem gene by abscisic acid and the transcriptional activator VP1: analysis of cis-acting promoter elements required for regulation by abscisic acid and VP1. Plant J. 1995, 7: 913-925.
Hobo T, Kowyama Y, Hattori T: A bZIP factor, TRAB1, interacts with VP1 and mediates abscisic acid-induced transcription. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96: 15348-15353.
Kagaya Y, Hobo T, Murata M, Ban A, Hattori T: Abscisic acid-induced transcription is mediated by phosphorylation of an abscisic acid response element binding factor, TRAB1. Plant Cell. 2002, 14: 3177-3189.
Sugimoto K, Takeda S, Hirochika H: Transcriptional activation mediated by binding of a plant GATA-type zinc finger protein AGP1 to the AG-motif (AGATCCAA) of the wound-inducible Myb gene NtMyb2. Plant J. 2003, 36: 550-564.
Meyer A, Eskandari S, Grallath S, Rentsch D: AtGATl, a high affinity transporter for gamma-aminobutyric acid in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 2006.
Pih KT, Yi MJ, Liang YS, Shin BJ, Cho MJ, Hwang I, Son D: Molecular cloning and targeting of a fibrillarin homolog from Arabidopsis. Plant Physiol. 2000, 123: 51-58.
Yao N, Greenberg JT: Arabidopsis ACCELERATED CELL DEATH2 Modulates Programmed Cell Death. Plant Cell. 2005.
Sheen J: Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 2001, 127: 1466-1475.
Tabara H, Grishok A, Mello CC: RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 1998, 282: 430-431.
Vanitharani R, Chellappan P, Fauquet CM: Short interfering RNA-mediated interference of gene expression and viral DNA accumulation in cultured plant cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100: 9632-9636.
Chern M, Fitzgerald HA, Canlas PE, Navarre DA, Ronald PC: Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of defense response and hypersensitivity to light. Mol Plant Microbe Interact. 2005, 18: 511-520.
Song WY, Wang GL, Chen LL, Kim HS, Pi LY, Holsten T, Gardner J, Wang B, Zhai WX, Zhu LH: A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science. 1995, 270: 1804-1806.
An CI, Sawada A, Fukusaki E, Kobayashi A: A transient RNA interference assay system using Arabidopsis protoplasts. Biosci Biotechnol Biochem. 2003, 67: 2674-2677.
An CI, Sawada A, Kawaguchi Y, Fukusaki E, Kobayashi A: Transient RNAi induction against endogenous genes in Arabidopsis protoplasts using in vitro-prepared double-stranded RNA. Biosci Biotechnol Biochem. 2005, 69: 415-418.
Zentella R, Yamauchi D, Ho TH: Molecular dissection of the gibberellin/abscisic acid signaling pathways by transiently expressed RNA interference in barley aleurone cells. Plant Cell. 2002, 14: 2289-2301.
Holzberg S, Brosio P, Gross C, Pogue GP: Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant J. 2002, 30: 315-327.
Christensen AH, Quail PH: Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res. 1996, 5: 213-218.
Chern MS, Bobb AJ, Bustos MM: The regulator of MAT2 (ROM2) protein binds to early maturation promoters and represses PvALF-activated transcription. Plant Cell. 1996, 8: 305-321.