Molecular and Cellular Biology

Chúng tôi đã xây dựng một loạt các hệ gen tái tổ hợp, nhằm điều khiển sự biểu hiện của enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT) trong các tế bào động vật có vú. Hệ gen tái tổ hợp nguyên mẫu trong loạt này, pSV2-cat, bao gồm gen beta-lactamase và khởi đầu cho sự tái bản từ pBR322 nối với vùng phiên mã sớm của virus khỉ 40 (SV40) mà vào đó các trình tự mã hóa cho CAT đã được chèn vào. Mức độ CAT tích lũy có thể đo lường dễ dàng trong vòng 48 giờ sau khi DNA pSV2-cat được đưa vào tế bào thận khỉ xanh châu Phi CV-1. Do không có hoạt tính CAT nội sinh trong CV-1 hoặc các tế bào động vật có vú khác, và do có sẵn các xét nghiệm nhanh, nhạy cảm cho hoạt tính CAT, nên các hệ gen tái tổ hợp này cung cấp một hệ thống độc đáo thuận tiện để giám sát sự biểu hiện của DNA ngoại lai trong các tế bào nuôi cấy mô. Để chứng minh tính hữu dụng của hệ thống này, chúng tôi đã xây dựng các dẫn xuất của pSV2-cat mà từ đó một phần hoặc toàn bộ vùng promoter SV40 đã bị loại bỏ. Việc xóa một bản sao của trình tự lặp 72 cặp bazơ trong vùng promoter SV40 không gây giảm đáng kể trong việc tổng hợp CAT trong các tế bào thận khỉ; tuy nhiên, việc xóa thêm 50 cặp bazơ từ bản sao thứ hai của các trình tự lặp đã làm giảm tổng hợp CAT xuống còn 11% mức của dạng hoang dã. Chúng tôi cũng đã xây dựng một hệ gen tái tổ hợp, pSV0-cat, trong đó toàn bộ vùng promoter SV40 đã bị loại bỏ và một vị trí HindIII độc nhất đã được thay thế để chèn các trình tự promoter khác.

Chúng tôi mô tả một quy trình chuyển giao đơn giản sử dụng phosphat canxi và các vector neo marker, đạt được hiệu quả chuyển đổi cao cho tế bào động vật có vú. Trong quy trình này, phức hợp phosphat canxi-DNA hình thành dần dần trong môi trường trong quá trình ấp ủ với tế bào và lắng đọng trên tế bào. Các yếu tố quan trọng để đạt được sự chuyển đổi hiệu quả là pH (6.95) của dung dịch đệm được sử dụng để lắng đọng phosphat canxi, nồng độ CO2 (3%) trong suốt quá trình ấp ủ DNA với tế bào, và lượng (20 đến 30 microgam) cùng hình thức (hình tròn) của DNA. Với sự tương phản rõ rệt so với kết quả với DNA hình tròn, DNA dạng thẳng gần như không hoạt động. Dưới những điều kiện này, 50% tế bào L(A9) của chuột có thể được chuyển đổi ổn định bằng pcDneo, một vector neo marker dựa trên virus linh trưởng 40 (kháng neomycin). Các dòng tế bào NIH3T3, C127, CV1, BHK, CHO, và HeLa đã được chuyển đổi với hiệu suất từ 10 đến 50% với vector này và các vector pcD đã tích hợp marker neo được sử dụng để xây dựng và truyền dẫn các thư viện biểu hiện cDNA cũng như để biểu hiện cDNA đã được nhân bản trong tế bào động vật có vú.

Chuỗi nucleotide của gen luciferase từ đom đóm Photinus pyralis đã được xác định thông qua phân tích cDNA và các mẫu gen. Gen này chứa sáu intron, tất cả đều có độ dài dưới 60 nucleotid. Đầu 5' của mRNA luciferase đã được xác định thông qua phân tích enzym S1 nuclease và mở rộng mồi. Mặc dù mẫu cDNA luciferase thiếu sáu mã di truyền N-đầu của khung đọc mở, chúng tôi đã có thể tái tạo lại tương đương với cDNA toàn bộ chiều dài bằng cách sử dụng mẫu gen như nguồn để lấy đoạn 5' còn thiếu. Gen luciferase toàn bộ chiều dài, không có intron đã được chèn vào các vector biểu hiện ở động vật có vú và được đưa vào các tế bào khỉ (CV-1) trong đó luciferase của đom đóm hoạt động enzym đã được biểu hiện tạm thời. Ngoài ra, các dòng tế bào biểu hiện luciferase đom đóm một cách ổn định đã được phân lập. Việc xóa một phần của vùng không dịch mã 5'-của gen luciferase đã loại bỏ một mã khởi đầu (AUG) nằm ở phía thượng lưu và dẫn đến sự gia tăng gấp đôi mức độ biểu hiện luciferase. Khả năng của gen luciferase toàn bộ chiều dài trong việc kích hoạt các promoter ẩn hoặc không có enhancer cũng bị suy giảm hoặc loại bỏ bởi việc xóa 5' này. Việc xét nghiệm biểu hiện luciferase cung cấp một phương pháp nhanh chóng và chi phí thấp để theo dõi hoạt động của các promoter. Tùy thuộc vào thiết bị được sử dụng để phát hiện hoạt động luciferase, chúng tôi ước tính rằng phương pháp thử nghiệm này nhạy hơn từ 30 đến 1,000 lần so với xét nghiệm biểu hiện acetyltransferase chloramphenicol.

Sáu kháng thể đơn dòng đã được tách chiết từ chuột được miễn dịch với các kháng nguyên peptide tổng hợp, có trình tự được lấy từ sản phẩm của gen c-myc ở người. Năm trong số các kháng thể này kết tụ p62c-myc từ các tế bào của người, và ba trong số năm kháng thể này cũng nhận diện sản phẩm gen c-myc ở chuột. Không có kháng thể nào phát hiện được protein p110gag-myc ở gà. Tất cả sáu kháng thể đều nhận diện p62c-myc trên màng miễn dịch. Các thuốc thử này cũng cung cấp cơ sở cho một thử nghiệm miễn dịch để định lượng p62c-myc trong các tế bào.

Chúng tôi đã xác định được một yếu tố tăng cường dài 50 nucleotide từ trình tự ngoại vi 3' của gen erythropoietin ở người, có khả năng trung gian cho việc kích thích phiên mã gấp bảy lần khi được nhân bản ở vị trí 3' của gen báo cáo promoter-chloramphenicol acetyltransferase do virus simian 40 điều khiển và được biểu hiện tạm thời trong các tế bào Hep3B. Các nucleotide (nt) từ 1 đến 33 của trình tự này trung gian cho việc kích thích gấp bảy lần biểu hiện gen báo cáo khi có mặt dưới dạng hai bản sao liên tiếp, so với việc kích thích gấp ba lần khi có mặt dưới dạng một bản sao đơn, cho thấy rằng các nt từ 34 đến 50 gắn với một yếu tố làm tăng cường tín hiệu kích thích. Phân tích dấu vết DNase I đã chứng minh sự gắn kết của một yếu tố hạt nhân cấu trúc với các nt từ 26 đến 48. Các nghiên cứu đột biến đã chỉ ra rằng các nt từ 4 đến 12 và từ 19 đến 23 là thiết yếu cho việc kích thích, vì việc thay thế tại bất kỳ vị trí nào đã loại bỏ biểu hiện do thiếu oxy. Các thử nghiệm dịch chuyển di electrophoretic đã xác định một yếu tố hạt nhân gắn với một đầu dò bao gồm các nt từ 1 đến 18 nhưng không gắn với một đầu dò chứa một đột biến đã vô hiệu hóa chức năng tăng cường. Việc gắn kết của yếu tố này đã được kích thích bởi thiếu oxy và sự kích thích này nhạy cảm với điều trị cycloheximide. Chúng tôi đã định nghĩa một yếu tố tăng cường có chức năng ba phần, dài 50 nt, có thể kích thích bởi thiếu oxy và gắn kết với một số yếu tố hạt nhân, một trong số đó được kích thích bởi thiếu oxy thông qua tổng hợp protein mới.