Molecular and Cellular Biology

Saccharomyces cerevisiae chứa một họ lớn các gen liên quan đến hsp70, gen cảm ứng sốc nhiệt chính của Drosophila melanogaster. Một tiểu họ, được xác định bằng phương pháp đồng thuận trình tự, chứa bốn gen: SSA1, SSA2, SSA3 và SSA4 (trước đây được gọi là YG100, YG102, YG106 và YG107, tương ứng). Các nghiên cứu trước đây cho thấy các dòng tế bào mang đột biến ở SSA1 và SSA2 nhạy cảm với nhiệt độ trong quá trình phát triển. SSA4, thường được cảm ứng bởi nhiệt và không được biểu hiện trong quá trình phát triển sinh dưỡng, được biểu hiện ở mức cao trong các dòng ssa1 ssa2 tại 23 độ C. Chúng tôi đã tạo ra các đột biến trong SSA3 và SSA4 và phân tích các dòng mang đột biến ở bốn gen. Các dòng mang đột biến trong SSA3 SSA4 hoặc SSA3 và SSA4 không thể phân biệt được với chủng hoang dã. Tuy nhiên, các dòng ssa1 ssa2 ssa4 không thể tồn tại được. SSA3, giống như SSA4, là một gen cảm ứng bởi nhiệt không được biểu hiện bình thường ở 23 độ C. Tuy nhiên, một bản sao nguyên vẹn của SSA3 được điều chỉnh bởi promoter SSA2 liên tục có khả năng cứu sống một dòng ssa1 ssa2 ssa4. Điều này cho thấy SSA3 mã hóa một protein chức năng và rằng sản phẩm của các gen SSA1, SSA2, SSA3 và SSA4 có sự tương đồng chức năng.

Ít nhất bốn protein có trọng lượng phân tử từ 70.000 đến 75.000 (70-75K) đã được tổng hợp từ mRNA, đã liên kết với một gen sốc nhiệt được nhân bản mà trước đó đã được xác định là nằm tại các vị trí puff sốc nhiệt 87A và 87C. Những protein này được tổng hợp in vitro không thể phân biệt với các protein được tổng hợp in vivo kích thích bởi sốc nhiệt khi được phân tích trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide. Một so sánh về mẫu của nhóm protein này được tổng hợp in vivo trong một xung 5 phút hoặc trong quá trình đánh dấu liên tục chỉ ra rằng các protein 72-75K có thể không phải là tiền chất động học cho protein sốc nhiệt chính 70K. Các sản phẩm tiêu hóa một phần được tạo ra bằng cách sử dụng protease V8 cho thấy rằng các protein sốc nhiệt 70-75K có mối quan hệ gần gũi, nhưng giữa chúng có sự khác biệt rõ ràng. Các mẫu tiêu hóa một phần thu được từ protein sốc nhiệt của dòng tế bào Kc và từ giống Oregon R của Drosophila melanogaster rất tương đồng. Phân tích di truyền về các mẫu tổng hợp protein sốc nhiệt 70-75K cho thấy rằng các gen mã hóa ít nhất hai trong ba protein sốc nhiệt 72-75K nằm ngoài các vị trí puff chính 87A và 87C.

Kháng thể đơn dòng đã được sử dụng để xác định ba protein ở Drosophila melanogaster có chung các yếu tố kháng nguyên với các protein sốc nhiệt chính hsp70 và hsp68. Trong khi hai protein này là các protein chính ở tất cả các giai đoạn phát triển, một protein tương đồng với sốc nhiệt, hsc70, đặc biệt được làm giàu ở phôi. hsc70 được chứng minh là sản phẩm của một gen đã được xác định trước đó, Hsc4. Chúng tôi đã kiểm tra mức độ của các protein liên quan đến hsp70 ở ruồi trưởng thành và ấu trùng trong quá trình sốc nhiệt và quá trình phục hồi. Tại sự kích thích tối đa trong cơ thể, hsp70 và hsp68 không bao giờ đạt được mức cơ bản của các protein tương đồng với sốc nhiệt chính. Kháng thể đơn dòng đối với hsc70 đã được sử dụng để định vị nó trong một mạng lưới các sợi tế bào chất tập trung nặng nề xung quanh nhân tế bào.

Chúng tôi đã tách được trình điều khiển của gen người mã hóa protein điều hòa bằng glucose 94,000 dalton (GRP94). Khu vực 5'-flanking quan trọng cho sự biểu hiện của gen này đã được xác định thông qua phân tích xóa bỏ. Sự so sánh giữa các trình điều khiển của các gen GRP78 và GRP94 lấy từ tế bào người, chuột và gà cho thấy một miền chung dài 28 cặp cơ sở trong các vùng điều hòa dự kiến của cả hai gen. Miền này đã được chứng minh là tương tác với các yếu tố protein trong trình điều khiển của gen GRP78. Vì các gen GRP94 và GRP78 được điều chỉnh phiên mã với động học tương tự dưới nhiều điều kiện căng thẳng khác nhau, chúng tôi quan tâm đến việc kiểm tra các cơ chế có thể có cho sự biểu hiện phối hợp của chúng. Thông qua các thử nghiệm cạnh tranh trong ống nghiệm và trong cơ thể sống, chúng tôi phát hiện ra rằng các yếu tố protein tương tác với trình điều khiển của gen GRP94 cũng có ái lực với miền bảo tồn của trình điều khiển của gen GRP78. Những phát hiện này cho thấy các gen GRP94 và GRP78 được điều chỉnh một cách phối hợp thông qua các yếu tố chuyển vi đã nhận diện một miền điều hòa chung của các trình điều khiển gen protein điều hòa bằng glucose.

Gen mã hóa GRP78 đã được chứng minh là được biểu hiện liên tục ở nhiều loại tế bào và có thể bị kích thích bởi ionophore canxi A23187. Để hiểu quy trình điều hòa phiên mã GRP78, chúng tôi đã phân tích các thành phần kiểm soát biểu hiện ở mức cơ bản của nó. Bằng cách chuyển gen các loại thiếu vào tế bào, chúng tôi đã xác định một yếu tố điều tiết cis-acting dài 54 nucleotide quan trọng cho biểu hiện ở mức cơ bản cao và một yếu tố liên tiếp dài 50 nucleotide cho cả biểu hiện ở mức cơ bản và sự cảm ứng bởi A23187. Sử dụng thử nghiệm footprint DNase với cả trình điều khiển GRP78 của chuột và người, chúng tôi đã chứng minh rằng các yếu tố protein có trong chiết xuất hạt nhân tế bào HeLa liên kết với các vùng điều tiết được xác định bởi các nghiên cứu thiếu. Miền này chứa một chuỗi đối xứng và được bảo tồn cao giữa các gen GRP ở Caenorhabditis elegans, gà, chuột và con người.

Gen nhiệt ứng hậc 4 (hsc4) của Drosophila, một thành viên của gia đình gen hsp70, mã hóa một protein phong phú, hsc70, có cấu trúc tương đồng hơn với protein được biểu hiện liên tục ở người hơn là hsp70 có thể kích thích nhiệt ở Drosophila. Sự biểu hiện trong phát triển tiết lộ rằng các bản sao hsc4 được làm giàu trong các tế bào hoạt động trong quá trình nội bào và những tế bào đang trải qua sự phát triển nhanh chóng và thay đổi hình dạng.

Một gen lai trong đó sự biểu hiện của gen beta-galactosidase từ Escherichia coli được đặt dưới sự kiểm soát của promoter của gen protein sốc nhiệt 70.000 dalton (hsp70) từ Drosophila melanogaster đã được xây dựng. Các biến thể đột biến của gen lai này có các chuỗi promoter với chiều dài khác nhau đã được chuẩn bị, và sự biểu hiện của chúng do nhiệt gây ra đã được kiểm tra trong tế bào D. melanogaster và tế bào COS-1 (thận của khỉ xanh châu Phi). Các đột biến có các chuỗi không dịch mã ở đầu 5' với độ dài ít nhất 90 và lên tới 1.140 cặp bazơ đã được biểu hiện mạnh mẽ trong cả hai loại tế bào. Các đột biến có các phần mở rộng ở 5' ngắn hơn (ít nhất 63 cặp bazơ) đã được sao chép và dịch mã hiệu quả ở tế bào COS-1 nhưng hoàn toàn không ở tế bào D. melanogaster. Do đó, trái ngược với tình huống ở tế bào COS-1, chuỗi đồng nhất nhiệt đã được xác định trước đó nằm giữa các nucleotide 62 và 48 của đoạn DNA không dịch mã 5' của gen hsp70 không đủ cho sự biểu hiện của gen D. melanogaster trong các tế bào đồng hình. Một yếu tố đồng nhất thứ hai nằm cách vị trí đầu mút 69 đến 85 nucleotide được giả thuyết cũng liên quan đến sự biểu hiện do nhiệt của gen hsp70 trong tế bào D. melanogaster.

SSC1 là một thành viên thiết yếu của họ gen đa dạng HSP70 ở nấm men (E. Craig, J. Kramer, và J. Kosic-Smithers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4156-4160, 1987). Phân tích chuỗi DNA của SSC1 tiết lộ rằng nó có thể mã hóa một protein 70,627 dalton, có nhiều sự tương đồng hơn với DnaK, một protein hsp70 của Escherichia coli, hơn là các protein hsp70 khác của nấm men mà đã được xác định chuỗi. Ssc1p được phát hiện có một phần mở đầu ở đầu amino dài 28 amino acid, so với Ssa1p, một protein hsp70 khác của nấm men, hoặc Dnak. Phần lãnh đạo giả thuyết này giàu các amino acid kiềm và hydroxyl, đặc trưng cho nhiều chuỗi lãnh đạo của ty thể. Ssc1p được tổng hợp in vitro có thể được nhập vào ty thể và đã bị cắt trong quá trình này. Protein được nhập vào có cùng di chuyển với một protein ty thể phong phú phản ứng với kháng thể đặc hiệu hsp70. Chúng tôi kết luận rằng Ssc1p là một protein ty thể và rằng các protein hsp70 thực hiện chức năng trong nhiều khoang của tế bào.

Chúng tôi đã xác định được một yếu tố tăng cường dài 50 nucleotide từ trình tự ngoại vi 3' của gen erythropoietin ở người, có khả năng trung gian cho việc kích thích phiên mã gấp bảy lần khi được nhân bản ở vị trí 3' của gen báo cáo promoter-chloramphenicol acetyltransferase do virus simian 40 điều khiển và được biểu hiện tạm thời trong các tế bào Hep3B. Các nucleotide (nt) từ 1 đến 33 của trình tự này trung gian cho việc kích thích gấp bảy lần biểu hiện gen báo cáo khi có mặt dưới dạng hai bản sao liên tiếp, so với việc kích thích gấp ba lần khi có mặt dưới dạng một bản sao đơn, cho thấy rằng các nt từ 34 đến 50 gắn với một yếu tố làm tăng cường tín hiệu kích thích. Phân tích dấu vết DNase I đã chứng minh sự gắn kết của một yếu tố hạt nhân cấu trúc với các nt từ 26 đến 48. Các nghiên cứu đột biến đã chỉ ra rằng các nt từ 4 đến 12 và từ 19 đến 23 là thiết yếu cho việc kích thích, vì việc thay thế tại bất kỳ vị trí nào đã loại bỏ biểu hiện do thiếu oxy. Các thử nghiệm dịch chuyển di electrophoretic đã xác định một yếu tố hạt nhân gắn với một đầu dò bao gồm các nt từ 1 đến 18 nhưng không gắn với một đầu dò chứa một đột biến đã vô hiệu hóa chức năng tăng cường. Việc gắn kết của yếu tố này đã được kích thích bởi thiếu oxy và sự kích thích này nhạy cảm với điều trị cycloheximide. Chúng tôi đã định nghĩa một yếu tố tăng cường có chức năng ba phần, dài 50 nt, có thể kích thích bởi thiếu oxy và gắn kết với một số yếu tố hạt nhân, một trong số đó được kích thích bởi thiếu oxy thông qua tổng hợp protein mới.