Journal of Clinical Microbiology

Chúng tôi đã phát triển một quy trình đơn giản, nhanh chóng và đáng tin cậy cho việc tinh chế quy mô nhỏ DNA và RNA từ, ví dụ, huyết thanh người và nước tiểu. Phương pháp này dựa trên đặc tính phân hủy và bất hoạt nuclease của tác nhân chaotropic guanidinium thiocyanate cùng với các đặc tính liên kết axit nucleic của các hạt silica hoặc diatom trong sự hiện diện của tác nhân này. Bằng việc sử dụng các hạt silica được phân đoạn kích thước, các axit nucleic (DNA vòng kín liên kết cộng hóa trị, DNA vòng thoải mái, DNA chuỗi đôi thẳng, DNA đơn chuỗi và rRNA) có thể được tinh chế từ 12 mẫu khác nhau trong thời gian chưa đến 1 giờ và được thu hồi trong bình phản ứng ban đầu. DNA tinh chế (dù đã bị cắt xén đáng kể) là một nền tảng tốt cho các endonuclease giới hạn và DNA ligase và được thu hồi với sản lượng cao (thường trên 50%) từ mức picogram đến microgram. rRNA đồng tinh chế được thu hồi gần như không bị phân hủy. Việc thay thế các hạt silica được phân đoạn kích thước bằng diatom (các tường tế bào hóa thạch của tảo đơn bào) đã cho phép tinh chế một lượng nhỏ DNA gen, DNA plasmid và rRNA từ các nguồn chứa tế bào phong phú, như được minh chứng đối với vi khuẩn gram âm gây bệnh. Trong bài viết này, chúng tôi trình bày các thí nghiệm tiêu biểu minh họa một số đặc điểm của quy trình, có thể có ứng dụng rộng rãi trong vi sinh vật lâm sàng.

Một chỉ số định lượng về khả năng phân biệt của các phương pháp phân loại được miêu tả, dựa trên khả năng hai chủng không liên quan nào đó được xác định là cùng loại. Chỉ số này có thể được sử dụng để so sánh các phương pháp phân loại và chọn ra hệ thống có khả năng phân biệt tốt nhất.

Một phương pháp phân loại gen nội qua nhiều điểm (MLST) đã được phát triển cho Staphylococcus aureus. Các trình tự của các đoạn gen nội nhà ở của bảy gen đã được lấy cho 155 phân lập S. aureus từ các bệnh nhân mắc các bệnh xâm lấn mắc phải cộng đồng và bệnh viện tại vùng Oxford, Vương quốc Anh. Năm mươi ba hồ sơ kiểu hình khác nhau đã được xác định, và 17 trong số này được đại diện bởi ít nhất hai phân lập. Phương pháp MLST có tính phân biệt cao và được xác nhận bằng cách chỉ ra rằng các cặp phân lập có hồ sơ kiểu hình giống nhau tạo ra các mẫu mảnh phân cách theo cách điện di trường xung nhịp rất tương tự. Các phân lập 22 có hồ sơ kiểu hình phổ biến nhất đều là các phân lập S. aureus kháng methicillin (MRSA) và có các hồ sơ kiểu hình giống hệt với một chủng tham khảo của dòng MRSA dịch bệnh 16 (EMRSA-16). Bốn phân lập MRSA có kiểu hình cũng giống như dòng MRSA dịch bệnh chính khác phổ biến trong các bệnh viện Anh (dòng EMRSA-15) cũng đã được xác định. Phần lớn các phân lập (81%) là các phân lập S. aureus không kháng methicillin (MSSA), và bảy dòng MSSA bao gồm năm hoặc nhiều hơn phân lập. Ba dòng MSSA bao gồm ít nhất năm phân lập từ các bệnh nhân mắc các bệnh xâm lấn mắc phải cộng đồng và có thể đại diện cho các dòng độc lực với khả năng gây bệnh tăng lên ở những cá nhân bình thường khỏe mạnh. Dòng MSSA phổ biến nhất (17 phân lập) có liên quan rất gần đến EMRSA-16, và sự thành công của dòng sau trong việc gây bệnh tại bệnh viện có thể do sự nổi lên từ một dòng MSSA độc lực đã là nguyên nhân chính của bệnh xâm lấn trong cả cộng đồng và bệnh viện. MLST cung cấp một phương pháp không mơ hồ để chỉ định các phân lập MRSA và MSSA vào các dòng đã biết hoặc chỉ định chúng như là các dòng mới qua Internet.

Hơn 700 loài vi khuẩn hoặc phylotype, trong đó hơn 50% chưa được nuôi cấy, đã được phát hiện trong khoang miệng. Mục tiêu của chúng tôi là (i) sử dụng các kỹ thuật phân tử độc lập với nuôi cấy để mở rộng kiến thức về sự đa dạng vi khuẩn trong khoang miệng của con người khỏe mạnh, bao gồm cả những loài vi khuẩn chưa được nuôi cấy, và (ii) xác định tính đặc hiệu theo vị trí và đối tượng của sự thuộc địa của vi khuẩn. Chín vị trí từ năm đối tượng lâm sàng khỏe mạnh đã được phân tích. Các vị trí này bao gồm mặt lưng của lưỡi, hai bên lưỡi, biểu mô má, khẩu cái cứng, khẩu cái mềm, mảng bám trên bề mặt răng, mảng bám bên dưới nướu, tiền đình hàm trên và amidan. Gen 16S rRNA từ DNA mẫu đã được khuếch đại, nhân bản và chuyển vào Escherichia coli . Các chuỗi gen 16S rRNA đã được sử dụng để xác định danh tính loài hoặc họ hàng gần nhất. Trong 2.589 mẫu nhân bản, 141 loài chủ yếu đã được phát hiện, trong đó hơn 60% chưa được nuôi cấy. Mười ba phylotype mới đã được xác định. Các loài chung cho tất cả các vị trí thuộc về các chi Gemella , Granulicatella , Streptococcus , và Veillonella . Trong khi một số loài có tính đặc hiệu theo đối tượng và được phát hiện ở hầu hết các vị trí, các loài khác lại có tính đặc hiệu theo vị trí. Hầu hết các vị trí có từ 20 đến 30 loài chủ yếu khác nhau, và số lượng loài chủ yếu từ cả chín vị trí trên mỗi cá nhân nằm trong khoảng từ 34 đến 72. Các loài thường liên quan đến bệnh nha chu và sâu răng không được phát hiện. Có một hệ vi sinh vật vi khuẩn chủ yếu đặc trưng của khoang miệng khỏe mạnh, rất đa dạng và có tính đặc hiệu theo vị trí và đối tượng. Việc hoàn toàn xác định hệ vi sinh vật của khoang miệng khỏe mạnh của con người là rất quan trọng trước khi chúng ta có thể hiểu được vai trò của vi khuẩn trong các bệnh lý miệng.

Việc sử dụng rộng rãi phương pháp đa hình chiều dài đoạn hạn chế DNA (RFLP) để phân biệt các chủng của Mycobacterium tuberculosis nhằm theo dõi sự lây truyền của bệnh lao đã gặp khó khăn do cần phải nuôi cấy vi sinh vật phát triển chậm này và do mức độ phức tạp kỹ thuật cần thiết để thực hiện phân loại RFLP. Chúng tôi đã phát triển một phương pháp đơn giản cho phép phát hiện và phân loại M. tuberculosis trong các mẫu lâm sàng một cách đồng thời, giảm thời gian từ khi nghi ngờ bệnh đến khi phân loại từ 1 hoặc vài tháng xuống còn 1 đến 3 ngày. Phương pháp này dựa trên tính đa hình của locus chromosomal DR, chứa một số lượng biến đổi các lặp lại trực tiếp ngắn xen kẽ với các khoảng cách không lặp lại. Phương pháp được gọi là oligotyping khoảng cách hoặc "spoligotyping" vì nó dựa trên các mô hình lai phụ thuộc vào chủng của DNA được khuếch đại in vitro với nhiều oligonucleotide khoảng cách. Hầu hết các mẫu lâm sàng đã thử nghiệm cho thấy các mô hình lai độc nhất, trong khi các chủng có ổ dịch chia sẻ cùng một spoligotype. Các loại thu được từ việc kiểm tra trực tiếp các mẫu lâm sàng là tương đương với các loại thu được bằng cách sử dụng DNA từ M. tuberculosis được nuôi cấy. Nghiên cứu sơ bộ mới này cho thấy phương pháp mới có thể là một công cụ hữu ích để nhanh chóng tiết lộ các trường hợp dịch bệnh liên quan trong cộng đồng, trong bệnh viện hoặc các tổ chức khác và để theo dõi sự lây truyền của M. tuberculosis kháng đa thuốc. Đáng ngạc nhiên, spoligotyping được phát hiện có khả năng phân biệt M. bovis với M. tuberculosis, một sự phân biệt thường khó thực hiện bằng các phương pháp truyền thống.

Phân tích vân tay DNA của Mycobacterium tuberculosis đã được chứng minh là một công cụ dịch tễ học mạnh mẽ. Chúng tôi đề xuất một kỹ thuật tiêu chuẩn hóa khai thác sự biến đổi cả về số lượng và vị trí gen của IS6110 để tạo ra các mẫu đặc trưng cho từng chủng. Việc sử dụng rộng rãi kỹ thuật này sẽ cho phép so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác nhau. Những so sánh như vậy sẽ tạo điều kiện cho các cuộc điều tra về sự lây truyền bệnh lao trên quy mô quốc tế và có thể xác định các chủng cụ thể với các đặc tính độc đáo như khả năng lây nhiễm cao, độc lực hoặc kháng thuốc.

Sự bám dính của Staphylococcus koaguláz âm tính lên các bề mặt nhẵn đã được đo lường bằng cách đo mật độ quang học của các lớp vi khuẩn nhuộm bám trên đáy của các đĩa nuôi cấy mô bằng plastic. Mật độ quang học có tương quan với trọng lượng của lớp vi khuẩn bám (r = 0.906; P nhỏ hơn 0.01). Các phép đo này cũng nhất quán với đánh giá trực quan về sự bám dính của vi khuẩn lên các ống nuôi cấy, các đĩa vi tiểu quản, và các đĩa nuôi cấy mô. Các chủng lâm sàng đã chọn đã được chuyển qua một mô hình chuột cho các nhiễm trùng do vật ngoại lai và một mô hình chuột cống cho viêm nội tâm mạch do catheter. Các phép đo bám dính của các chủng đã qua mô hình động vật vẫn giữ cùng mức với chủng cha được duy trì trong phòng thí nghiệm. Việc phân loại Staphylococcus koaguláz âm tính bằng quang phổ kế thành các loại bám dính và không bám dính theo những phép đo này có độ nhạy, độ đặc hiệu, và độ chính xác lần lượt là 90.6%, 80.8%, và 88.4%. Chúng tôi đã nghiên cứu một bộ sưu tập đã được mô tả trước đó bao gồm 127 chủng Staphylococcus koaguláz âm tính được tách ra từ một đợt bùng phát nhiễm trùng máu liên quan đến catheter mạch; các chủng liên quan đến nhiễm trùng có độ bám dính cao hơn so với các tạp chất từ nuôi cấy máu và các chủng da (P nhỏ hơn 0.001). Chúng tôi cũng đã xem xét một bộ sưu tập 84 chủng được tách ra từ các bệnh nhi có ống dẫn dịch não tủy; một lần nữa, các chủng gây bệnh có độ bám dính cao hơn so với các tạp chất dịch não tủy (P nhỏ hơn 0.01). Cuối cùng, chúng tôi đã đo độ bám dính của bảy chủng gây viêm nội tâm mạch. Ngược lại với các chủng liên quan đến catheter mạch và ống dẫn dịch não tủy, các chủng viêm nội tâm mạch có độ bám dính thấp hơn so với các chủng sống ký sinh của Staphylococcus koaguláz âm tính. Mật độ quang học của các lớp vi khuẩn bám dính lên các đĩa nuôi cấy mô bằng plastic phục vụ như một mô hình định lượng để nghiên cứu về sự bám dính của Staphylococcus koaguláz âm tính lên các thiết bị y tế, quy trình có thể quan trọng trong quá trình sinh bệnh của các nhiễm trùng do vật ngoại lai.

Chúng tôi báo cáo về việc phát triển và ứng dụng của một phương pháp kiểm tra nhanh để phát hiện và phân loại virus dengue. Các mồi oligonucleotide đồng thuận đã được thiết kế để gắn kết với bất kỳ trong bốn loại virus dengue nào và khuếch đại một sản phẩm 511-bp trong một phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược (PCR). Đầu tiên, chúng tôi đã tạo ra một bản sao cDNA của một phần của bộ gen virus trong một phản ứng sao chép ngược với sự hiện diện của mồi D2 và sau đó thực hiện một PCR tiêu chuẩn (35 chu kỳ biến tính nhiệt, gắn kết và kéo dài mồi) với sự bổ sung của mồi D1. Sản phẩm DNA sợi kép kết quả từ RT-PCR đã được phân loại bằng hai phương pháp: lai chấm của sản phẩm 511-bp đã được khuếch đại với các đầu dò đặc thù loại virus dengue hoặc một đợt PCR khuếch đại thứ hai (PCR lồng) với các mồi đặc thù theo loại, tạo ra sản phẩm DNA có kích thước duy nhất chẩn đoán được cho từng kiểu huyết thanh của virus dengue. Dữ liệu tích lũy đã cho thấy rằng virus dengue có thể được phát hiện và phân loại chính xác từ các mẫu huyết thanh người đang trong giai đoạn viremia.