Journal of Cell Science

Kể từ khi phát hiện ra protein Sprouty (Spry) điển hình trong Drosophila, đã có những nỗ lực nhằm xác định cách mà các modulators mới này của con đường Ras/MAP-kinase hoạt động. Một manh mối về cơ chế hoạt động của chúng đến từ một số chuỗi được bảo tồn cao trong tất cả các isoform Spry đã được biết đến: một chuỗi chứa khoảng 110 amino acid giàu cysteine ở nửa C-terminus, định hướng các protein Spry đến một nồng độ cao của các protein tín hiệu tại màng tế bào; một motif nhỏ xung quanh một residue tyrosine (Y55 trong hSpry2) có trách nhiệm trong tương tác với các protein khác. Trong các tế bào động vật có vú nuôi cấy, hSpry2 ức chế quá trình nội bào hóa của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và sau đó duy trì sự kích hoạt của MAP kinase nhưng lại điều chỉnh tiêu cực con đường này sau khi kích thích thụ thể yếu tố tăng trưởng fibroblast (FGFRs). Bằng chứng hiện tại chỉ ra rằng Cbl là một protein chính tương tác trực tiếp với Spry2 sau khi kích hoạt thụ thể tyrosine kinase (RTKs). Có vẻ như khả năng của Cbl tương tác như một E3 ubiquitin ligase trên các protein mục tiêu cụ thể và như một protein bám dính trong các ngữ cảnh khác nhau quyết định các tác động khác nhau mà Spry2 có trên con đường Ras/MAP-kinase sau khi kích hoạt EGFR và FGFR.

Chúng tôi mô tả một phương pháp có thể tái lập để nuôi cấy biểu mô ruột non (xuất phát từ ruột của chuột con) trong các nền văn hóa ngắn hạn (sơ cấp). Các điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định thông qua các thử nghiệm định lượng về sự sinh sản (tức là sự thay đổi trong số lượng tế bào và tổng hợp DNA). Việc tách biệt biểu mô và, đáng lưu ý, việc bảo tồn tính toàn vẹn ba chiều của nó được thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật tiêu hóa collagenase/dispase. Sự tinh khiết của biểu mô cũng được tăng cường nhờ vào phương pháp lắng phân biệt đơn giản.

Các kết quả được trình bày dưới đây ủng hộ ý tưởng rằng sự sinh sản của biểu mô ruột bình thường ex vivo phụ thuộc ban đầu vào việc duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của mô này và vào các yếu tố được sản xuất bởi các tế bào trung mô không đồng nhất. Sự sinh sản trong ống nghiệm cũng phụ thuộc quan trọng vào chất lượng của môi trường và các thành phần sử dụng.

Các nền văn hóa đạt được độ bão hòa trong vòng 10–14 ngày và bao gồm các thuộc địa biểu mô cùng với các lượng tế bào giống như cơ trơn khác nhau. Các nền văn hóa đã được duy trì trong thời gian lên tới một tháng, nhưng tiềm năng phát triển lâu dài của việc nhân giống chưa được kiểm tra. Các chiến lược để giảm sự sinh sản của các tế bào không phải biểu mô này cũng được mô tả.

Trong tình trạng quá tải áp lực hoặc thể tích, sự tăng trưởng phì đại của cơ tim có liên quan đến sự biệt hóa myofibroblast, một quá trình mà trong đó các fibroblast tim biểu hiện α-actin cơ trơn (SMA). Các cơ chế tín hiệu trung gian sự biệt hóa myofibroblast và biểu hiện SMA do lực gây ra vẫn chưa được xác định. Chúng tôi đã khảo sát vai trò của con đường Rho–Rho-kinase trong việc biểu hiện SMA do lực gây ra ở các fibroblast bằng hệ thống mô hình in vitro áp dụng lực kéo tĩnh (0.65 pN/μm2) lên các integrin thông qua các hạt từ tính được phủ collagen. Lực tối đa kích hoạt RhoA sau 10 phút ở các vị trí ứng dụng lực và yêu cầu các sợi actin nguyên vẹn. Việc áp dụng lực đã kích thích phosphoryl hóa LIM kinase (5-10 phút) và phosphoryl hóa giảm sớm của cofilin (5 phút) sau đó được theo sau bởi phosphoryl hóa kéo dài của cofilin. Những phản ứng này đã bị chặn bởi Y27632, một loại thuốc ức chế Rho kinase. Lực đã thúc đẩy sự lắp ráp các sợi actin tại các vị trí ứng dụng lực (10-20 phút), một quá trình yêu cầu Rho kinase và cofilin. Việc áp dụng lực đã dẫn đến sự di chuyển vào nhân của đồng hoạt hóa phiên mã MRTF-A nhưng không phải MRTF-B. Sự di chuyển vào nhân của MRTF-A yêu cầu Rho kinase và các sợi actin nguyên vẹn. Lực gây ra sự gia tăng gấp 3.5 lần hoạt động của trình điều khiển SMA, điều này hoàn toàn bị chặn bởi việc chuyển gen vào các tế bào với MRTF-A có tính áp đảo hoặc bằng cách ức chế Rho kinase hoặc bằng cách phân tách các sợi actin. Những dữ liệu này chỉ ra rằng các lực cơ học trung gian sự lắp ráp actin thông qua con đường Rho–Rho-kinase–LIMK cofilin. Sự lắp ráp sợi actin trung gian bởi lực thúc đẩy sự di chuyển vào nhân của MRTF và kích hoạt tiếp theo trình điều khiển SMA để tăng cường việc biểu hiện SMA.

Các liên kết tế bào biểu mô là những cấu trúc đặc biệt kết nối các tế bào riêng lẻ trong mô biểu mô. Chúng có mối liên hệ động và chức năng với bộ xương tế bào actin. Việc tháo dỡ các liên kết này là một sự kiện chính trong quá trình sinh lý và bệnh lý, nhưng cách mà điều này ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen vẫn chưa được xác định rõ. Ở đây, chúng tôi điều tra xem việc tháo dỡ các liên kết có điều chỉnh quá trình phiên mã qua yếu tố phản ứng huyết thanh (SRF) và đồng hoạt hóa viên MAL/MRTF hay không. Sự tách rời tính toàn vẹn biểu mô phụ thuộc vào Ca2+ được phát hiện có mối tương quan chặt chẽ với quá trình phiên mã trung gian SRF. Ở các tế bào thiếu sự biểu hiện của E-cadherin, không quan sát thấy sự kích hoạt SRF. Chúng tôi cung cấp bằng chứng trực tiếp cho thấy quá trình tín hiệu diễn ra qua actin monomeric và MAL. Sự tách rời các liên kết tế bào biểu mô đi kèm với việc kích thích RhoA và Rac1. Tuy nhiên, sử dụng các độc tố cytotoxin từ Clostridium, chúng tôi chứng minh rằng Rac, nhưng không phải RhoA, là cần thiết cho sự kích thích SRF và gen mục tiêu ở các tế bào biểu mô, trái ngược với các nguyên bào sợi được kích thích bởi huyết thanh. Khả năng co bóp của actomyosin là một điều kiện tiên quyết cho việc tín hiệu nhưng không kích thích được sự hoạt hóa SRF, loại bỏ vai trò đủ của con đường Rho-ROCK-actomyosin. Chúng tôi kết luận rằng các liên kết tế bào biểu mô phụ thuộc vào E-cadherin tạo điều kiện cho sự kích hoạt phiên mã thông qua Rac, G-actin, MAL và SRF khi xảy ra sự phân giải biểu mô.

Tau là nhóm các protein liên kết vi ống thần kinh, được hình thành thông qua quá trình cắt ghép mRNA thay thế và tích lũy trong các đám rối neurofibrillary ở não bệnh Alzheimer (AD). Tau đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh động lực học vi ống, vận chuyển trục axon và sự phát triển của neurite, và tất cả các chức năng này của tau được điều tiết bởi phosphoryl hóa tại vị trí cụ thể. Có bằng chứng rõ ràng rằng sự gián đoạn các sự kiện phosphoryl hóa bình thường dẫn đến sự rối loạn chức năng tau trong các bệnh thoái hóa thần kinh, chẳng hạn như AD, và là một yếu tố góp phần vào các quá trình gây bệnh. Thực tế, phosphoryl hóa tau bất thường xảy ra trong các tình trạng thoái hóa thần kinh không chỉ dẫn đến mất chức năng độc hại (ví dụ: giảm khả năng kết nối vi ống) mà còn có thể dẫn đến việc gia tăng chức năng độc hại (ví dụ: tăng cường tương tác tau-tau). Mặc dù tau được phosphoryl hóa in vitro bởi nhiều protein kinase khác nhau, nhưng số lượng protein kinase thực sự phosphoryl hóa tau in vivo thì vẫn chưa rõ ràng. Việc xác định các protein kinase phosphoryl hóa tau in vivo trong cả quá trình sinh lý và bệnh lý có thể cung cấp các mục tiêu điều trị tiềm năng cho việc điều trị AD và các bệnh thoái hóa thần kinh khác có liên quan đến tổn thương tau.

Khi nghiên cứu tác động của chloral hydrate lên quá trình phân bào, chúng tôi phát hiện rằng việc áp dụng 0,1% chloral hydrate ngoài tế bào gây ra sự gia tăng đột ngột nồng độ Ca2+ tự do trong bào tương. Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang kỹ thuật số trên các tế bào PtK đang trong quá trình phân bào và ở pha nghỉ cho thấy nồng độ Ca2+ tăng lên sau 15 giây kể từ khi áp dụng chloral hydrate, đạt đỉnh trong vòng 1 phút với nồng độ gấp hai đến bảy lần mức cơ bản và sau đó từ từ giảm xuống. Việc ngâm tế bào trong 0,1% chloral hydrate làm cho các thoi phân bào ở giữa bị rút ngắn, bắt đầu từ 1-2 phút, và ức chế sự kéo dài của thoi phân bào mà không ảnh hưởng đến sự chuyển động của nhiễm sắc thể về phía cực trong quá trình anaphase, được xác định qua quan sát bằng phương pháp tương phản pha trên các tế bào sống. Sự kéo dài của thoi phân bào và chuyển động của nhiễm sắc thể không bị ảnh hưởng bởi việc tiêm nội bào 7,5% chloral hydrate. Xuất hiện sự phân hủy microtubule phân bào đáng kể xảy ra sau khi tế bào được ngâm trong 0,1% chloral hydrate trong 7 phút, trong khi các microtubule ở pha nghỉ không bị ảnh hưởng như đã được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Sự phân hủy microtubule do chloral hydrate gây ra và sự rút ngắn thoi phân bào được ngăn chặn bởi 10mM-CoCl2, đã được chứng minh trước đó là có khả năng chặn dòng Ca2+ vào tế bào và ổn định microtubules trong ống nghiệm. Những kết quả này ngụ ý rằng việc làm gián đoạn chức năng và cấu trúc của thoi phân bào do chloral hydrate là do sự gia tăng nồng độ Ca2+ tự do trong bào tương, và cũng chỉ ra rằng các microtubule phân bào nhạy cảm với Ca2+ hơn so với microtubules ở pha nghỉ.

Trong giai đoạn đầu của quá trình gây ung thư, sự chuyển hóa xảy ra trong một tế bào đơn lẻ trong một lớp biểu mô. Tuy nhiên, điều gì xảy ra ở ranh giới giữa các tế bào bình thường và các tế bào đã bị chuyển hóa vẫn chưa được biết. Sử dụng tế bào thận chó Madin-Darby (MDCK) đã chuyển hóa với v-Src nhạy cảm với nhiệt độ, chúng tôi đã nghiên cứu giao diện giữa các tế bào biểu mô bình thường và các tế bào biểu mô bị chuyển hóa Src. Chúng tôi cho thấy rằng các tế bào bị chuyển hóa Src được đẩy ra khỏi bề mặt khi được bao quanh bởi các tế bào bình thường, nhưng không khi các tế bào Src đơn độc được nuôi cấy, điều này cho thấy rằng sự đẩy ra bề mặt xảy ra theo một cách phụ thuộc vào bối cảnh tế bào. Chúng tôi cũng quan sát thấy sự đẩy ra bề mặt của các tế bào bị chuyển hóa Src trong lớp bao bọc của phôi gastrula cá tếch. Khi các tế bào MDCK bị chuyển hóa Src được bao quanh bởi các tế bào MDCK bình thường, myosin-II và kinase gắn kết tâm điểm (FAK) được kích hoạt trong các tế bào Src, điều này làm kích hoạt thêm các protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) phía dưới. Quan trọng là, sự kích hoạt của các con đường tín hiệu này phụ thuộc vào sự hiện diện của các tế bào bình thường xung quanh và đóng một vai trò quan trọng trong sự đẩy ra bề mặt của các tế bào Src. Tóm lại, những kết quả này chỉ ra rằng sự tương tác với các tế bào biểu mô bình thường xung quanh ảnh hưởng đến các con đường tín hiệu và hành vi của các tế bào bị chuyển hóa Src.

Việc phân loại các tiểu thế cơ xương thường được thực hiện độc lập với hiệu suất chức năng của chúng sau khi chuyển giao. Sử dụng kỹ thuật tiền lớp, kỹ thuật tách biệt tế bào dựa trên các đặc điểm bám dính biến đổi, chúng tôi đã nghiên cứu việc sử dụng các protein bề mặt tế bào để có thể xác định các tiền thân có khả năng tái tạo nâng cao. Dựa trên các nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã sử dụng phân loại tế bào để điều tra sự biểu hiện kháng nguyên tế bào gốc-1 (Sca-1) và CD34 trên các quần thể cơ xương có các đặc điểm bám dính muộn. Chúng tôi đã so sánh hiệu quả tái tạo của các tiền thân được phân loại này, cũng như các quần thể tế bào thể hiện đặc điểm bám dính sớm, bằng cách định lượng khả năng của chúng trong việc tái tạo cơ xương và phục hồi dystrophin sau khi được chuyển giao vào cơ chủ loài dị hình.

Việc xác định và khai thác các quần thể bám dính muộn dựa trên sự biểu hiện của CD34 dẫn đến sự tái tạo khác biệt, với các quần thể tích cực CD34 thể hiện sự cải thiện đáng kể trong việc phục hồi dystrophin so với cả các quần thể âm tính CD34 và các quần thể tế bào bám dính sớm. Khả năng tái tạo được tìm thấy tương ứng với mức độ cam kết cơ xương, được xác định bởi sự biểu hiện yếu tố điều hòa cơ xương, cũng như tỷ lệ và mức độ phân hóa và hợp nhất tế bào được kích thích. Những kết quả này cho thấy khả năng tách biệt các tiểu quần thể cơ xương có thể định nghĩa dựa trên sự biểu hiện của CD34 và làm sáng tỏ các ý nghĩa tiềm năng của việc xác định hành vi và đặc điểm hình thái tế bào cơ xương liên quan đến khả năng tái tạo của chúng trong cơ thể sống.

Sự thay đổi trong biểu hiện và phân bố của các lamin hạt nhân đã được nghiên cứu trong quá trình phân hóa tế bào cơ C2C12. Biểu hiện của hầu hết các lamin không thay đổi trong quá trình myogenesis. Ngược lại, biểu hiện của lamin-B2 tăng lên trong khi biểu hiện của LAP2α giảm đi gấp hai lần. Những thay đổi này có tương quan với khả năng hòa tan giảm và sự phân bố lại của các lamin loại A. Khi tế bào cơ C2C12 được chuyển gen với một đột biến lamin-A gây ra bệnh loạn dưỡng cơ di truyền trội tự động Emery-Dreifuss (AD-EDMD), protein đột biến tích tụ trong chất nhân và có tác động chiếm ưu thế lên các lamin nội sinh. Các tế bào cơ được chuyển gen với lamin kiểu hoang dã vẫn phân hóa, mặc dù chậm hơn, trong khi các tế bào cơ được chuyển gen với lamin đột biến không thể phân hóa. Sự phân hóa tế bào cơ yêu cầu quá trình khử phosphoryl hóa protein retinoblastoma Rb. Trong quá trình myogenesis, Rb đã được khử phosphoryl hóa một cách nhanh chóng và dần dần. Rb ít phosphoryl hóa tạo thành các phức hợp với LAP2α trong các tế bào cơ đang tăng sinh và các tế bào cơ sau phân bào. Trong các tế bào cơ được chuyển gen với các lamin đột biến, phức hợp này bị gián đoạn. Những dữ liệu này cho thấy rằng việc tái cấu trúc của khung nucleoskeleton là cần thiết cho sự phân hóa cơ xương và cho việc điều chỉnh đúng các con đường Rb.

Sự phân hóa của trypanosome châu Phi từ các dạng hình sợi sinh sản ở trong máu thành các dạng không phân chia là hình stumpy hạn chế kích thước quần thể ký sinh trùng, cho phép sự tồn tại của vật chủ động vật có vú và thiết lập mối quan hệ ký sinh vật chủ ổn định. Sử dụng một hệ thống nuôi cấy in vitro mới, chúng tôi đã chỉ ra rằng sự phân hóa từ hình sợi sang hình stumpy chỉ được kích thích bởi mật độ ký sinh trùng và do đó không phụ thuộc vào các tín hiệu từ vật chủ. Ở đây, chúng tôi điều tra cơ chế cảm nhận mật độ và cho thấy rằng trypanosome giải phóng một hoạt tính hòa tan có trọng lượng phân tử tương đối thấp, được gọi là yếu tố kích thích hình stumpy (SIF), mà tích tụ trong môi trường thích nghi. Hoạt tính SIF kích thích dừng chu kỳ tế bào ở pha G1/G0 và gây ra sự phân hóa với hiệu quả cao và động học nhanh. Các dẫn xuất thẩm thấu qua màng của cAMP hoặc chất ức chế phosphodiesterase là etazolate hoàn toàn mô phỏng hoạt động của SIF. Hơn nữa, hoạt tính SIF gây ra sự gia tăng ngay lập tức từ hai đến ba lần nội bào nội dung cAMP sau khi thêm vào các dạng hình sợi. Chúng tôi kết luận rằng SIF và do đó cảm nhận mật độ hoạt động thông qua con đường tín hiệu cAMP. Tương quan theo thời gian của các dấu hiệu chỉ ra rằng dừng chu kỳ tế bào luôn đi trước sự phân hóa. Do đó, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng sự điều chỉnh chu kỳ tế bào của các dạng trong máu nằm dưới sự kiểm soát thống trị của tín hiệu cAMP. Sự cam kết không thể đảo ngược đối với trạng thái thiền tĩnh được kích thích bởi một agonist cAMP trong một khoảng thời gian ngắn hơn một chu kỳ tế bào hoàn chỉnh.