Journal of Bacteriology

Trình bày một bộ các mồi oligonucleotide có khả năng khởi đầu quá trình khuếch đại enzym (phản ứng chuỗi polymerase) trên một phạm vi rộng các loại vi khuẩn về mặt phát sinh chủng loài và phân loại, cùng với các phương pháp sử dụng chúng và các ví dụ minh họa. Một cặp mồi có khả năng khuếch đại gần như đầy đủ chiều dài DNA ribosome 16S (rDNA) từ nhiều chi vi khuẩn; các mồi bổ sung có ích cho các trình tự đặc biệt khác. Các phương pháp tinh chế vật liệu được khuếch đại, giải trình tự trực tiếp, nhân bản, giải trình tự và phiên mã được phác thảo. Một ký sinh trùng bắt buộc sống trong tế bào của hồng cầu bò, Anaplasma marginale, được sử dụng làm ví dụ; rDNA 16S của nó đã được khuếch đại, nhân bản, giải trình tự và phân loại phát sinh chủng loài. Anaplasmas có liên quan đến các chi Rickettsia và Ehrlichia. Ngoài ra, rDNAs 16S từ một số loài đã được khuếch đại một cách dễ dàng từ các vật liệu có trong các ống lyophilized từ Bộ sưu tập Văn hóa Loại Mỹ. Bằng cách sử dụng phương pháp này, nghiên cứu phát sinh chủng loài của các loài vi khuẩn cực kỳ cầu kỳ hoặc có độc lực cao có thể được thực hiện mà không cần nuôi cấy chúng. Về mặt lý thuyết, bất kỳ đoạn gen nào mà có thể thiết kế mồi cho phản ứng chuỗi polymerase có thể được lấy từ một văn hóa vi khuẩn lyophilized dễ dàng thu được.

Các tế bào nấm men nguyên vẹn được điều trị bằng các cation kiềm đã tiếp nhận DNA plasmid. Li+, Cs+, Rb+, K+ và Na+ đều có hiệu quả trong việc gây ra khả năng chuyển đổi. Các điều kiện để chuyển đổi Saccharomyces cerevisiae D13-1A với plasmid YRp7 đã được nghiên cứu một cách chi tiết với CsCl. Thời gian ấp tối ưu là 1 giờ, và nồng độ tế bào tối ưu là 5 x 10(7) tế bào/ml. Nồng độ tối ưu của Cs+ là 1.0 M. Hiệu suất chuyển đổi tăng khi nồng độ DNA plasmid tăng lên. Polyethylen glycol là hoàn toàn cần thiết. Nhiệt độ và các polyamine hoặc protein cơ bản khác nhau đã kích thích sự tiếp nhận DNA plasmid. Ngoài DNA hình tròn, DNA plasmid dạng thẳng cũng đã được tế bào nấm men điều trị bằng Cs+ tiếp nhận, mặc dù hiệu suất tiếp nhận đã giảm đáng kể. Hiệu suất chuyển đổi với Cs+ hoặc Li+ tương đương với các phương pháp protoplast truyền thống đối với một plasmid chứa ars1, mặc dù không phải với các plasmid chứa nguồn gốc phái sinh 2 microns.

Các phân tích hạn chế chi tiết của nhiều mẫu thường yêu cầu một lượng thời gian và công sức đáng kể để chiết xuất DNA, thực hiện các phản ứng cắt hạn chế, blotting Southern, và quá trình lai ghép. Chúng tôi mô tả một phương pháp mới sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để_typing hạn chế nhanh chóng và đơn giản và lập bản đồ DNA từ nhiều chủng loại khác nhau. Các đoạn DNA có độ dài lên đến 2 kilobase pairs đã được khuếch đại hiệu quả từ các mẫu DNA thô của một số loài Cryptococcus gây bệnh, bao gồm C. neoformans, C. albidus, C. laurentii, và C. uniguttulatus. Việc tiêu hóa và điện di các sản phẩm PCR bằng cách sử dụng các enzyme cắt hạn chế thường xuyên đã tạo ra các kiểu hình cắt hạn chế phức tạp (dấu vân tay) thường là duy nhất cho mỗi chủng hoặc loài. Chúng tôi đã sử dụng PCR để khuếch đại và phân tích sự biến đổi của mẫu cắt hạn chế trong ba phần chính của các đoạn DNA ribosome (rDNA) từ những loại nấm này. Việc lập bản đồ chi tiết nhiều vị trí cắt hạn chế trong locus rDNA đã được xác định qua phân tích dấu vân tay của các đoạn PCR ngày càng lớn chia sẻ một vị trí mồi chung ở một đầu. Theo dấu vân tay PCR, rDNA của 19 chủng C. neoformans cho thấy không có sự biến đổi nào đối với bốn enzyme cắt hạn chế mà chúng tôi đã khảo sát. Các loài Cryptococcus khác cho thấy mức độ biến đổi mẫu cắt hạn chế khác nhau trong rDNAs của chúng và đã được chứng minh là khác biệt về mặt di truyền so với C. neoformans. Các mồi PCR được sử dụng trong nghiên cứu này cũng đã được áp dụng thành công để khuếch đại rDNAs từ các loại nấm gây bệnh và không gây bệnh khác, bao gồm cả loài Candida, và có khả năng ứng dụng rộng rãi cho phát hiện lâm sàng cũng như các nghiên cứu khác.

Chúng tôi đã xây dựng một loạt các vector plasmid (vector pBAD) chứa promoter PBAD của operon araBAD (arabinose) và gen mã hóa yếu tố điều hòa dương tính và âm tính của promoter này, araC. Sử dụng gen phoA và các hợp nhất phoA để theo dõi biểu hiện trong các vector này, chúng tôi cho thấy rằng tỷ lệ kích thích/giảm biểu hiện có thể lên tới 1,200 lần, so với 50 lần đối với các vector dựa trên PTAC. Biểu hiện phoA có thể được điều chỉnh trong một phạm vi rộng các nồng độ chất kích thích (arabinose) và giảm xuống mức cực thấp nhờ sự hiện diện của glucose, chất này ức chế biểu hiện. Hơn nữa, động học của sự kích thích và ức chế rất nhanh chóng và bị ảnh hưởng đáng kể bởi alen ara trong chủng vi khuẩn. Do đó, việc sử dụng hệ thống này có thể được bật và tắt một cách hiệu quả và nhanh chóng cho phép nghiên cứu những khía cạnh quan trọng của sinh lý vi khuẩn theo cách rất đơn giản và không cần thay đổi nhiệt độ. Chúng tôi đã khai thác quy định chặt chẽ của promoter PBAD để nghiên cứu các kiểu hình của những đột biến không có chức năng của các gen thiết yếu và khám phá việc sử dụng các vector pBAD như một hệ thống biểu hiện.

Xây dựng và đặc trưng một lớp phương tiện nhân bản plasmid đa bản chứa hệ thống tái sinh của miniplasmid P15A được mô tả. Các plasmid được xây dựng có điểm cắt nằm trong các gen kháng kháng sinh cho một loạt các endonuclease đặc hiệu đã được sử dụng, cho phép áp dụng quy trình làm bất hoạt chèn để lựa chọn các dòng chứa phân tử DNA lai. Mặc dù các plasmid được xây dựng cho thấy sự đồng hình DNA với plasmid ColE1 trong vùng tái sinh, có thể khuếch đại bằng chloramphenicol hoặc spectinomycin, yêu cầu DNA polymerase I cho quá trình tái sinh, và có các đặc tính tái sinh khác giống như ColE1, nhưng chúng vẫn tương thích với ColE1. Các plasmid có nguồn gốc từ P15A không tự truyền được và có khả năng di động kém bởi các dòng Hfr; tuy nhiên, khả năng di động được cải thiện khi có sự hiện diện của plasmid ColE1 trong cùng một tế bào.

Các quy trình được mô tả để phát hiện và tách biệt plasmid có kích thước khác nhau (2,6 đến 350 megadalton) được chứa trong các loài Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, Salmonella, Erwinia, Pseudomonas và Xanthomonas. Phương pháp này sử dụng các đặc điểm phân tử của axit deoxyribonucleic vòng kín (DNA) liên kết covalent được giải phóng khỏi tế bào trong các điều kiện làm biến tính DNA nhiễm sắc thể bằng cách sử dụng natri dodecyl sulfate kiềm (pH 12,6) ở nhiệt độ cao. Protein và các mảnh tế bào đã được loại bỏ bằng cách chiết xuất bằng phenol-chloroform. Dưới các điều kiện này, nồng độ DNA nhiễm sắc thể đã được giảm hoặc loại bỏ. Dịch chiết tinh khiết được sử dụng trực tiếp cho phân tích điện di. Những quy trình này cũng cho phép tách biệt có chọn lọc DNA plasmid có thể được sử dụng trực tiếp trong sự dịch chuyển, phân tích endonuclease hạn chế, chuyển đổi và thí nghiệm nhân bản DNA.

Gen toxR của Vibrio cholerae mã hóa một protein liên màng, có khả năng liên kết DNA, kích hoạt phiên mã của operon độc tố tả và một gen (tcpA) cho đơn vị chính của yếu tố thuộc địa pilus. Chúng tôi đã xây dựng các đột biến chèn có định hướng trong gen toxR bằng một phương pháp mới sử dụng sự tích hợp nhiễm sắc thể của một plasmid tự sát có thể di chuyển, chứa một phần của trình tự mã hóa toxR. Các đột biến chứa các alen toxR mới này có biểu hình protein màng ngoài bị thay đổi, gợi ý rằng hai protein màng ngoài chính (OmpT và OmpU) có thể được điều khiển bởi toxR. Các nghiên cứu sinh lý cho thấy việc thay đổi nồng độ các axit amin asparagine, arginine, glutamate và serine dẫn đến những thay đổi phối hợp trong việc biểu hiện độc tố tả, TcpA, OmpT và OmpU. Sự thay đổi trong thẩm thấu của môi trường dựa trên tryptone cũng gây ra những thay đổi phối hợp trong việc biểu hiện của các protein này. Các tín hiệu môi trường khác (nhiệt độ và pH) có ảnh hưởng rõ rệt hơn đến việc biểu hiện của độc tố tả và TcpA so với các protein màng ngoài. Những kết quả này gợi ý rằng một số tín hiệu môi trường nhất định (tức là thẩm thấu và sự hiện diện của axit amin) được gắn chặt với việc biểu hiện của các protein được điều chỉnh bởi toxR và do đó có thể là các tín hiệu mà Protein ToxR cảm nhận trực tiếp.