Journal of Bacteriology

We describe the development of an expression-secretion system in Bacillus subtilis to improve the quality and quantity of the secreted foreign proteins. This system consists of a strain (WB600) deficient in six extracellular proteases and a set of sacB-based expression vectors. With the inactivation of all six chromosomal genes encoding neutral protease A, subtilisin, extracellular protease, metalloprotease, bacillopeptidase F, and neutral protease B, WB600 showed only 0.32% of the wild-type extracellular protease activity. No residual protease activity could be detected when WB600 was cultured in the presence of 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. By using TEM beta-lactamase as a model, we showed that WB600 can significantly improve the stability of the secreted enzyme. To further increase the production level we constructed an expression cassette carrying sacY, a sacB-specific regulatory gene. This gene was placed under the control of a strong, constitutively expressed promoter, P43. With this cassette in the expression vector, an 18-fold enhancement in beta-lactamase production was observed. An artificial operon, P43-sacY-degQ, was also constructed. However, only a partial additive enhancement effect (24-fold enhancement) was observed. Although degQ can stimulate the production of beta-lactamase in the system, its ability to increase the residual extracellular protease activity from WB600 limits its application. The use of the P43-sacY cassette and WB600 would be a better combination for producing intact foreign proteins in high yield.

Mutants of Escherichia coli K-12 requiring considerably elevated concentrations of potassium for growth are readily obtained as double mutants combining a kdp mutation with a mutation in one or more of five other loci. These loci are referred to as trk , for transport of K, because these mutations result in alterations in K transport. The kdp mutation is essential in the isolation and identification of this type of mutant; in a Kdp ⁺ strain, the presence of a trk mutation does not prevent growth of the strain in media containing very low concentrations of K. The trk loci are widely scattered over the E. coli chromosome; none of them is very near any other trk locus or near the kdp genes.

Sự phân hủy có điều kiện của RpoS yêu cầu RssB và protease ClpXP. Các đột biến trong hns làm tăng cả sự tổng hợp và độ ổn định của RpoS, dẫn đến sự gia tăng gấp đôi trong tổng hợp và gần như hoàn toàn ổn định RpoS, không phụ thuộc vào các tác động đối với sự tổng hợp và không phụ thuộc vào quá trình phosphoryl hóa của RssB. Điều này gợi ý rằng H-NS điều chỉnh một hoặc nhiều chất ức chế RssB.

Safferman, Robert S. (Robert A. Taft Sanitary Engineering Center, Cincinnati, Ohio), và Mary-Ellen Morris . Đặc điểm tăng trưởng của virus tản ghi sắc khoang xanh LPP-1. J. Bacteriol. 88: 771–775. 1964.—Virus tản ghi sắc khoang xanh (BGA), chủng LPP-1, đã hình thành hai biến thể mảng rõ rệt. Trong quá trình sinh sản sau đó, mỗi biến thể được tách ra cuối cùng trở lại thành một hỗn hợp của cả hai loại mảng. Biến thể tạo mảng lớn, sinh sôi với tỷ lệ nhanh hơn một chút, cho thấy sự sản xuất virus tối đa trong vòng 60 giờ sau khi nhiễm; titter tối đa của biến thể mảng nhỏ đạt được sau 76 giờ ủ. Không có sự khác biệt nào được quan sát thấy trong quang phổ ký chủ của chúng cũng như khả năng ổn định pH và nhiệt độ của chúng. Bằng chứng đã được trình bày cho thấy rằng các mẫu virus BGA có thể được đánh giá với độ chính xác hợp lý từ số lượng mảng. Các biến thể phát sinh từ kỹ thuật cấy này nằm trong khoảng sai số thí nghiệm mà đã được báo cáo chung cho một hệ thống như vậy.

Một cuộc khảo sát về các enzym phosphatase hoặc phosphodiesterase của Salmonella typhimurium đã được thực hiện dưới nhiều điều kiện tăng trưởng khác nhau. Các nghiên cứu này đã tiết lộ sự hiện diện của ba enzym chính, tất cả đều đã được tinh chế sau đó: một cyclic 2' ,3'-nucleotide phosphodiesterase (EC 3.1.4.d), một acid hexose phosphatase (EC 3.1.3.2), và một nonspecific acid phosphatase (EC 3.1.3.2). Một enzym thứ tư đã thủy phân bis-(p-nitrophenyl)phosphate nhưng không thủy phân được bất kỳ hợp chất nào khác đã thử nghiệm. Không có bằng chứng nào được tìm thấy cho sự tồn tại của một alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1) hoặc một specific 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5) trong S. typhimurium LT2. Cả ba phosphatase đều có thể được đo một cách hiệu quả trong các tế bào nguyên vẹn, điều này gợi ý vị trí periplasmic; tuy nhiên, chúng không được giải phóng dễ dàng bằng các quy trình sốc thẩm thấu. Phosphatase acid không đặc hiệu, đã được tinh chế đến độ đồng nhất rõ ràng, đã tạo ra một dải polypeptide đơn trong cả hệ thống điện di gel natri dodecyl sulfate và gel điện di urê axit.

Các vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Yersinia tiết ra một số phân tử hiệu ứng khác nhau, được gọi là Yops, vào trong bào tương của tế bào eukaryote thông qua hệ thống tiết tấn công loại III. Để xác định các vùng của YopE từ Yersinia pseudotuberculosis cần thiết cho sự chuyển vị qua màng tế bào vi khuẩn và tế bào eukaryote, chúng tôi đã xây dựng một loạt các gen lai bao gồm nhiều lượng yopE được liên kết với miền mã hóa adenylate cyclase của gen cyclolysin (cyaA) từ Bordetella pertussis. Bằng cách kiểm tra hoạt động adenylate cyclase của các tế bào nguyên vẹn, chúng tôi cho thấy một protein YopE-Cya chứa chỉ 11 amino axit ở đầu N của YopE được xuất ra hiệu quả ra bề mặt ngoài của tế bào vi khuẩn. Việc thay thế từng amino axit trong bảy amino axit đầu tiên của YopE đã làm giảm đáng kể lượng protein báo cáo được phát hiện trên bề mặt tế bào, gợi ý rằng miền cực đầu N của YopE được công nhận bởi máy móc tiết tấn công. Như đã được chỉ ra gần đây đối với protein YopE của Y. enterocolitica (M.-P. Sory, A. Boland, I. Lambermont, và G. R. Cornelis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11998-12002, 1995), chúng tôi phát hiện rằng việc xuất ra bề mặt tế bào không đủ để protein YopE-Cya được chuyển vào bào tương của tế bào eukaryote. Để vượt qua màng tế bào HeLa, ít nhất 49 dư lượng mã hóa yopE là cần thiết. Việc thay thế leucine 43 của YopE bằng glycine đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc đưa protein báo cáo vào tế bào HeLa. Thật bất ngờ, việc xuất từ tế bào vi khuẩn cũng không đủ để protein YopE-Cya được giải phóng từ bề mặt tế bào vi khuẩn vào dịch nuôi cấy. Ít nhất 75 dư lượng YopE là cần thiết để phát hiện hoạt động của protein báo cáo tương ứng trong dịch nuôi cấy, cho thấy rằng có một miền giải phóng tồn tại trong vùng này của YopE. Chúng tôi cũng cho thấy rằng protein tương tự chaperone YerA cần tối thiểu 75 dư lượng YopE để tạo thành một phức hợp ổn định trong ống nghiệm với protein YopE-Cya và, hơn nữa, rằng YerA không cần thiết để định hướng protein YopE-Cya tới phức hợp tiết tấn công. Tổng hợp lại, kết quả của chúng tôi gợi ý rằng việc vượt qua màng vi khuẩn và eukaryote diễn ra bởi các quá trình riêng biệt công nhận các miền khác nhau của YopE và rằng các quá trình này không phụ thuộc vào hoạt động của YerA.

Hệ thống tiết protein kiểu III Hrp (TTSS) là cần thiết cho tính gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh thực vật Gram âm Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phân tích độ đa hình chiều dài đoạn sao chép cDNA và phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược đã xác định được các gen mới, được điều chỉnh bởi yếu tố điều hòa HrpG, trong các vùng rìa của cụm gen hrp . Phân tích chuỗi cho thấy có các gen mã hóa HpaG, một protein dự đoán có chứa repeate giàu leucine, protein HpaH giống lysozyme, và XopA cùng XopD, có trình tự tương tự như Hpa1 từ Xanthomonas oryzae pv. oryzae và PsvA từ Pseudomonas syringae , tương ứng. XopA và XopD ( Xanthomonas outer proteins) được tiết ra bởi TTSS Hrp của Xanthomonas và do đó đại diện cho các protein mục tiêu khả dĩ. Các đột biến trong xopA , nhưng không phải trong xopD , dẫn đến sự giảm sinh trưởng của vi khuẩn trong thực vật và sự phản ứng chậm của thực vật ở cả cây chủ nhạy cảm và kháng. Vì bộ điều hòa của xopD chứa một hộp hrp khả dĩ, đặc trưng cho các gen được điều chỉnh bởi hrpL trong P. syringae và Erwinia spp., gen này có thể đã được tiếp nhận thông qua chuyển giao gen theo chiều ngang. Thú vị là, các vùng rìa của cụm gen hrp cũng chứa các trình tự chèn và các gen cho một transposase khả dĩ và một tRNA ^Arg . Những đặc điểm này cho thấy rằng cụm gen hrp của X. campestris pv. vesicatoria là một phần của hòn đảo độc tính.

Sắc tố carotenoid đã được tinh chế từ một loài spirochete đỏ, vi sinh vật ưa muối (spirochete RS1), và từ chủng Spirochaeta aurantia J1 chưa được mô tả trước đó. Cả hai spirochete này đều là vi hiếu khí tuỳ ý và sản xuất sắc tố khi phát triển trong môi trường hiếu khí. Các sắc tố chính của hai spirochete được xác định thông qua phân tích sắc ký, quang phổ hấp thụ, khử hydro, acetyl hóa và silyl hóa, cũng như phổ khối lượng. Kết luận cho rằng sắc tố chính từ spirochete RS1 là 4-keto-1',2'-dihydro-1'-hydroxytorulene. Kết luận này còn được hỗ trợ thêm bởi quang phổ hồng ngoại và dữ liệu phân tích bổ sung. Bằng chứng cho thấy rằng sắc tố chính từ S. aurantia là 1',2'-dihydro-1'-hydroxytorulene. Bằng chứng từ phân tích sắc ký và quang phổ cũng chỉ ra rằng sắc tố này cũng tồn tại như một thành phần carotenoid nhỏ trong spirochete RS1. Những sắc tố này đã được phát hiện trước đó hầu như chỉ trong các vi khuẩn trượt, như các loài của Flexibacter, Stigmatella, và Myxococcus. Sự xuất hiện của 4-keto-1',2'-dihydro-1'-hydroxytorulene và 1',2'-dihydro-1'-hydroxytorulene trong cả hai spirochete và vi khuẩn trượt có thể có ý nghĩa liên quan đến sự phát triển tiến hóa của các sinh vật này.

Hydroxyneurosporene desaturase tham gia vào con đường sinh tổng hợp carotenoid của các loài Rhodobacter. Gene mã hóa enzyme này đã được biểu hiện trong Escherichia coli, tinh chế và được đặc trưng sinh hóa. Protein thu được chứa một đoạn mở đầu N-terminal với sáu histidine được lấy từ vector clon; điều này cho phép tinh chế enzyme một bước đến độ tinh khiết sau khi hòa tan bằng Nonidet P-40. Chất nhận hydro trong phản ứng desaturation C-3,4 là oxy phân tử. NAD+, NADP+ và flavin adenine dinucleotide không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym. Các 1-hydroxycarotenoid không vòng khác nhau đã được thử nghiệm như là các cơ chất. Sự chuyển hóa rất tốt đã đạt được với 1-hydroxyneurosporene và 1-hydroxylycopene, trong khi 1-hydroxy-gamma-carotene và 1,1'-dihydroxylycopene kém hiệu quả hơn rất nhiều. Từ 1'-hydroxy-3,4-didehydrolycopene chỉ thu được một lượng sản phẩm rất nhỏ, và 1-methoxyneurosporene không được chuyển đổi bởi hydroxyneurosporene desaturase tinh khiết. Một giá trị Km là 13,4 microM đã được xác định cho 1-hydroxyneurosporene.