Nhận diện gen nhanh chóng và lập bản đồ DNA ribosome được khuếch đại bằng enzyme từ một số loài Cryptococcus
Tóm tắt
Các phân tích hạn chế chi tiết của nhiều mẫu thường yêu cầu một lượng thời gian và công sức đáng kể để chiết xuất DNA, thực hiện các phản ứng cắt hạn chế, blotting Southern, và quá trình lai ghép. Chúng tôi mô tả một phương pháp mới sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để_typing hạn chế nhanh chóng và đơn giản và lập bản đồ DNA từ nhiều chủng loại khác nhau. Các đoạn DNA có độ dài lên đến 2 kilobase pairs đã được khuếch đại hiệu quả từ các mẫu DNA thô của một số loài Cryptococcus gây bệnh, bao gồm C. neoformans, C. albidus, C. laurentii, và C. uniguttulatus. Việc tiêu hóa và điện di các sản phẩm PCR bằng cách sử dụng các enzyme cắt hạn chế thường xuyên đã tạo ra các kiểu hình cắt hạn chế phức tạp (dấu vân tay) thường là duy nhất cho mỗi chủng hoặc loài. Chúng tôi đã sử dụng PCR để khuếch đại và phân tích sự biến đổi của mẫu cắt hạn chế trong ba phần chính của các đoạn DNA ribosome (rDNA) từ những loại nấm này. Việc lập bản đồ chi tiết nhiều vị trí cắt hạn chế trong locus rDNA đã được xác định qua phân tích dấu vân tay của các đoạn PCR ngày càng lớn chia sẻ một vị trí mồi chung ở một đầu. Theo dấu vân tay PCR, rDNA của 19 chủng C. neoformans cho thấy không có sự biến đổi nào đối với bốn enzyme cắt hạn chế mà chúng tôi đã khảo sát. Các loài Cryptococcus khác cho thấy mức độ biến đổi mẫu cắt hạn chế khác nhau trong rDNAs của chúng và đã được chứng minh là khác biệt về mặt di truyền so với C. neoformans. Các mồi PCR được sử dụng trong nghiên cứu này cũng đã được áp dụng thành công để khuếch đại rDNAs từ các loại nấm gây bệnh và không gây bệnh khác, bao gồm cả loài Candida, và có khả năng ứng dụng rộng rãi cho phát hiện lâm sàng cũng như các nghiên cứu khác.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Aulakh , H. J. , S. E. Strauss , and K. J. Kwon -chung. 1981 . Genetic relatedness of Filobasidiella neoformans (Cryptococcus neoformans) and Filobasidiella bacillispora (Cryptococcus bacillisporus) as determined by deoxyribonucleic acid base composition and sequence homology studies . Int. J. Syst. Bacteriol. 31 : 97 - 101 .
Bruns , T. D. , R. Fogel , and J. W. Taylor . 1990 . Amplification and sequencing of DNA from fungal herbarium specimens . Mycologia 82 : 175 - 184 .
de Miranda L. R. 1984. Cryptococcus Kutzing emend. Phaff et Spencer p. 845-872. In N. J. W. Kreger-van Rij (ed.) The yeasts a taxonomic study 3rd ed. Elsevier Amsterdam.
Felsenstein J. 1988. PHYLIP: phylogenetic inference package. Version 3.0. University of Washington Seattle.
Kurtzmnn , C. P. 1984 . DNA base sequence complementarity and the definition of fungal taxa . Microbiol. Sci. 1 : 44 48.
Kwok , S. , and R. Higuchl . 1989 . Avoiding false positives with PCR . Nature (London) 339 : 237 - 238 .
Kwon-Chung , K. J. 1975 . A new genus, Filobasidiella, the perfect state of Cryptococcus neoformans . Mycologia 67 : 1197 - 1200 .
Kwon-Chung K. J. J. E. Bennett and J. C. Rhodes. Taxonomic studies on Filobasidiella species and their anamorphs. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 48:25-38.
Kwon-Chung K. J. and J. W. Fefl. 1984. Genus 2. Filobasidiella Kwon Chung p. 472-482. In N. J. W. Kreger-van Rij (ed.) The yeasts a taxonomic study 3rd ed. Elsevier Amsterdam.
Kwon-Chung K. J. and J. W. Fell. 1984. Genus 3. Filobasidium Olive p. 483-491. In N. J. W. Kreger-van Rij (ed.) The yeasts a taxonomic study 3rd ed. Elsevier Amsterdam.
Lee S. B. and J. W. Taylor. 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores p. 282-287. In N. Innis D. Gelfand J. Sninsky and T. White (ed.) PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press Inc. New York.
Li , H. , U. B. Gyllensten , X. Cui , R. K. Saiki , H. A. Erlch , and N. Araheim . 1988 . Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells . Nature (London) 335 : 414 - 417 .
Magee , B. B. , T. M. D'Souza , and P. T. Magee . 1987 . Strain and species identification by restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal DNA repeat of Candida species . J. Bacteriol. 169 : 1639 - 1643 .
Maniatis T. E. F. Fritsch and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor N.Y.
Nei , M. , and W. -H. Li . 1979 . Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 5269 - 5273 .
Perfect , J. R. , B. B. Magee , and P. T. Magee . 1989 . Separation of chromosomes of Cryptococcus neoformans by pulsed field gel electrophoresis . Infect. Immun. 57 : 2624 - 2627 .
Phaff H. J. and J. W. Fell. 1970. Genus 3. Cryptococcus Kuitzing emend. Phaff et Spencer p. 1088-1145. In J. Lodder (ed.) The yeasts: a taxonomic study 2nd ed. North Holland Publishing Co. Amsterdam.
Restrepo , B. I. , and A. G. Barbour . 1989 . Cloning of 18S and 25S rDNAs from the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans . J. Bacteriol. 171 : 5596 - 5600 .
Saiki , R. K. , D. H. Gelfand , S. Stoffel , S. J. Scharf , R. Higuchi , G. T. Horn , K. B. Mullis , and H. A. Erlich . 1988 . Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase . Science 239 : 487 - 491 .
Vincent , R. D. , R. Goewart , W. E. Gokd _an, G. S. Kobayashi , A. M. Lambowitz , and G. Medoff . 1986 . Classification of Histoplasma capsulatum isolates by restriction fragment polymorphisms . J. Bacteriol. 165 : 813 - 818 .
White , T. J. , N. Arnheim , and H. A. Erlich . 1989 . The polymerase chain reaction . Trends Genet. 5 : 185 - 189 .