Quy định chặt chẽ, điều chỉnh và biểu hiện mức cao bằng các vector chứa promoter PBAD của arabinose
Tóm tắt
Chúng tôi đã xây dựng một loạt các vector plasmid (vector pBAD) chứa promoter PBAD của operon araBAD (arabinose) và gen mã hóa yếu tố điều hòa dương tính và âm tính của promoter này, araC. Sử dụng gen phoA và các hợp nhất phoA để theo dõi biểu hiện trong các vector này, chúng tôi cho thấy rằng tỷ lệ kích thích/giảm biểu hiện có thể lên tới 1,200 lần, so với 50 lần đối với các vector dựa trên PTAC. Biểu hiện phoA có thể được điều chỉnh trong một phạm vi rộng các nồng độ chất kích thích (arabinose) và giảm xuống mức cực thấp nhờ sự hiện diện của glucose, chất này ức chế biểu hiện. Hơn nữa, động học của sự kích thích và ức chế rất nhanh chóng và bị ảnh hưởng đáng kể bởi alen ara trong chủng vi khuẩn. Do đó, việc sử dụng hệ thống này có thể được bật và tắt một cách hiệu quả và nhanh chóng cho phép nghiên cứu những khía cạnh quan trọng của sinh lý vi khuẩn theo cách rất đơn giản và không cần thay đổi nhiệt độ. Chúng tôi đã khai thác quy định chặt chẽ của promoter PBAD để nghiên cứu các kiểu hình của những đột biến không có chức năng của các gen thiết yếu và khám phá việc sử dụng các vector pBAD như một hệ thống biểu hiện.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Belder , J. B. , M. Nguyen-Disteche , N. Houba-Herin , J. M. Ghuysen , I. N. Maruyama , H. Hara , Y. Hirota , and M. Inouye . 1988 . Overexpression, solubilization and refolding of a genetically engineered derivative of the penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli K12 . Mol. Microbiol. 2 : 519 - 525 .
Beverin , S. , D. E. Sheppard , and S. S. Park . 1971 . D-Fucose as a gratuitous inducer of the L-arabinose operon in strains of Escherichia coli B/r mutant in gene araC . J. Bacteriol. 107 : 79 - 86 .
Boyd , D. , C. Manoil , and J. Beckwith . 1987 . Determinants of membrane protein topology . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8525 - 8529 .
Brosius , J. , M. Erfle , and J. Storella . 1985 . Spacing of the ~10 and ~35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity . J. Biol. Chem. 260 : 3539 - 3541 .
Cagnon , C. , V. Valverde , and J. -M. Masson . 1991 . A new family of sugarinducible vectors for Escherichia coli . Protein Eng. 4 : 843 - 847 .
Carra , J. H. , and R. F. Schleif . 1993 . Variation of half-site organization and DNA looping by AraC protein . EMBO J. 12 : 35 - 44 .
Carson M. J. Unpublished results.
. Carson , M. J. , J. J. Barondess , and J. Beckwith . 1991 . The FtsQ protein of Escherichia coli: membrane topology, abundance, and cell division phenotypes due to overproduction and insertion mutations . J. Bacteriol. 173 : 2187 - 2195 .
Cass , L. G. , A. H. Horwitz , and G. Wilcox . 1981 . The araIc mutation in Escherichia coli B/r . J. Bacteriol. 146 : 1098 - 1105 .
Chang , A. C. Y. , and S. N. Cohen . 1978 . Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the p15A cryptic miniplasmid . J. Bacteriol. 134 : 1141 - 1156 .
Conley , M. P. , A. J. Wolfe , D. F. Blair , and H. C. Berg . 1989 . Both CheA and CheW are required for reconstitution of chemotactic signaling in Escherichia coli . J. Bacteriol. 171 : 5190 - 5193 .
Cull , M. G. , J. F. Miller , and P. J. Schatz . 1992 . Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 1865 - 1869 .
Dalbey , R. E. , and W. Wickner . 1985 . Leader peptidase catalyzes the release of exported proteins from the outer surface of the Escherichia coli plasma membrane . J. Biol. Chem. 260 : 15925 - 15931 .
de Boer , H. A. , L. J. Comstock , and M. Vasser . 1983 . The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 21 - 25 .
de Boer , P. A. J. , R. E. Crossley , and L. I. Rothfield . 1988 . Isolation and properties of minB, a complex genetic locus involved in correct placement of the division site in Escherichia coli . J. Bacteriol. 170 : 2106 - 2112 .
Diederich , L. , A. Roth , and W. Messer . 1994 . A versatile plasmid vector system for the regulated expression of genes in Escherichia coli . BioTechniques 16 : 916 - 923 .
Doherty , A. J. , B. A. Connolly , and A. F. Worrall . 1993 . Overproduction of the toxic protein, bovine pancreatic DNaseI, in Escherichia coli using a tightly controlled T7-promoter-based vector . Gene 136 : 337 - 340 .
Dong , H. , L. Nilsson , and C. G. Kurland . 1995 . Gratuitous overexpression of genes in Escherichia coli leads to growth inhibition and ribosome destruction . J. Bacteriol. 177 : 1497 - 1504 .
Elvin , C. M. , P. R. Thompson , M. E. Argall , P. Hendry , N. P. Stamford , P. E. Lilley , and N. E. Dixon . 1990 . Modified bacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli . Gene 87 : 123 - 126 .
Englesberg , E. , R. L. Anderson , R. Neinberg , N. Lee , P. Hoffee , G. Huttenhauer , and H. Boyer . 1962 . L-Arabinose-sensitive, L-ribulose 5-phosphate 4-epimerase-deficient mutants of Escherichia coli . J. Bacteriol. 84 : 137 - 146 .
Gil , D. , and J. P. Bouche . 1991 . ColE1-type vectors with fully repressible replication . Gene 105 : 17 - 22 .
Giza , P. E. , and R. C. Huang . 1989 . A self-inducing runaway-replication plasmid expression system utilizing the Rop protein . Gene 78 : 73 - 84 .
Guzman , L. - M. , J. J. Barondess , and J. Beckwith . 1992 . FtsL, an essential cytoplasmic membrane protein involved in cell division in Escherichia coli . J. Bacteriol. 174 : 7716 - 7728 .
Hoffmann , I. , J. Widstrom , M. Zeppezauer , and P. O. Nyman . 1987 . Overproduction and large-scale preparation of deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase from Escherichia coli . Eur. J. Biochem. 164 : 45 - 51 .
Johnston , S. , J. -H. Lee , and S. D. Ray . 1985 . High-level expression of M13 gene II protein from an inducible polycistronic messenger RNA . Gene 34 : 137 - 145 .
Kozak , M. 1983 . Comparison of initiation of protein synthesis in prokaryotes, eukaryotes and organelles . Microbiol. Rev. 47 : 1 - 45 .
Kuhn , A. , and W. Wickner . 1985 . Isolation of mutants in M13 coat protein that affect its synthesis, processing, and assembly into phage . J. Biol. Chem. 260 : 15907 - 15913 .
Larsen , J. E. L. , K. Gerdes , J. Light , and S. Molin . 1984 . Low-copy-number plasmid-cloning vectors amplifiable by derepression of an inserted foreign promoter . Gene 28 : 45 - 54 .
Lee N. 1980. Molecular aspects of ara regulation p. 389-410. In J. H. Miller and W. S. Reznikoff (ed.) The operon. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor N.Y.
Lee , N. , C. Francklyn , and E. P. Hamilton . 1987 . Arabinose-induced binding of AraC protein to araI2 activates the araBAD operon promoter . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8814 - 8818 .
Lobell , R. B. , and R. F. Schleif . 1990 . DNA looping and unlooping by AraC protein . Science 250 : 528 - 532 .
Lopilato , J. , S. Bortner , and J. Beckwith . 1986 . Mutations in a new chromosomal gene of Escherichia coli, pcnB, reduce plasmid copy number of pBR322 and its derivatives . Mol. Gen. Genet. 205 : 285 - 290 .
.Martin N. L. Unpublished results.
Miyada , C. G. , L. Stoltzfus , and G. Wilcox . 1984 . Regulation of the araC gene of Escherichia coli: catabolite repression, autoregulation, and effect on araBAD expression . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4120 - 4124 .
Mukherjee , A. , and W. D. Donachie . 1990 . Differential translation of cell division proteins . J. Bacteriol. 172 : 6106 - 6111 .
Murphy , C. K. , and J. Beckwith . 1994 . Residues essential for the function of SecE, a membrane component of the Escherichia coli secretion apparatus, are located in a conserved cytoplasmic region . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 2557 - 2561 .
O'Connor , C. D. , and K. N. Timmis . 1987 . Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic proteins . J. Bacteriol. 169 : 4457 - 4462 .
Phillips , G. J. , and T. J. Silhavy . 1992 . The E. coli ffh gene is necessary for viability and efficient protein export . Nature (London) 359 : 744 - 746 .
Pogliano , J. A. , and J. Beckwith . 1994 . SecD and SecF facilitate protein export in Escherichia coli . EMBO J. 13 : 554 - 561 .
.Polard P. and M. Chandler. Personal communication.
Russell , C. B. , R. C. Stewart , and F. W. Dahlquist . 1989 . Control of transducer methylation levels in Escherichia coli: investigation of components essential for modulation of methylation and demethylation reactions . J. Bacteriol. 171 : 3609 - 3618 .
Sambrook J. E. F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor N.Y.
San Millan , J. L. , D. Boyd , R. Dalbey , W. Wickner , and J. Beckwith . 1989 . Use of phoA fusions to study the topology of the Escherichia coli inner membrane protein leader peptidase . J. Bacteriol. 171 : 5536 - 5541 .
Shine , J. , and L. Dalgarno . 1974 . The 3~-terminal sequence of E. coli 16S ribosomal RNA: complementary to nonsense triplets and ribosome binding sites . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 : 1342 - 1346 .
Stormo , G. D. , T. D. Schneider , and T. M. Gold . 1982 . Characterization of translational initiation sites in E. coli . Nucleic Acids Res. 10 : 2971 - 2996 .
Strauch , K. L. , and J. Beckwith . 1988 . An Escherichia coli mutation preventing degradation of abnormal periplasmic proteins . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1576 - 1580 .
Tabor , S. , and C. C. Richardson . 1985 . A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1074 - 1078 .
Wagatsuma , M. , N. Asami , J. Miyachi , S. Uchida , H. Watanabe , and E. Amann . 1993 . Antibody recognition of the recombinant human nuclear antigens RNP 70kD, SS-B, and Sm-D by autoimmune sera . Mol. Immunol. 30 : 1491 - 1498 .
Wilcox , G. , K. J. Clemetson , P. Cleary , and E. Englesberg . 1974 . Interaction of the regulatory gene product with the operator site in the L-arabinose operon of Escherichia coli . J. Mol. Biol. 85 : 589 - 602 .
Yanisch-Perron , C. , J. Vieira , and J. Messing . 1985 . Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors . Gene 33 : 103 - 119 .
Yansura , D. G. , and D. J. Henner . 1990 . Use of Escherichia coli trp promoter for direct expression of proteins . Methods Enzymol. 185 : 54 - 60 .