BMC Microbiology

Các vùng Spacer được liên lạc nội bộ (ITS) của ADN ribosome nấm (rDNA) là những chuỗi có tính biến đổi cao, có tầm quan trọng lớn trong việc phân biệt các loài nấm thông qua phân tích PCR. Các mồi PCR đã được công bố trước đây để khuếch đại các chuỗi này từ các mẫu môi trường cung cấp mức độ thành công khác nhau trong việc phân biệt ADN thực vật trong khi vẫn duy trì một phạm vi tương thích rộng. Thông thường, cần phải sử dụng nhiều bộ mồi khác nhau để phù hợp với các loài nấm đang nghiên cứu, có thể tạo ra sự phân biệt giả tạo đối với các chuỗi nấm khuếch đại với nhiều bộ mồi khác nhau.

Nhiều chuỗi cho các mồi PCR đã được thử nghiệm để phát triển các thử nghiệm PCR với một phạm vi tương thích nấm rộng và khả năng phân biệt cao khỏi ADN thực vật. Một bộ mồi lồng ghép gồm 4 mồi đã được phát triển phù hợp với những tiêu chí này và đã thực hiện tốt việc khuếch đại các vùng ITS của rDNA nấm. Các mồi trong chuỗi 5.8S cũng đã được phát triển cho phép khuếch đại riêng biệt các vùng ITS1 và ITS2. Một loạt các thân quả của lớp Basidiomycete và các nền văn hóa Ascomycete đã được phân tích với bộ mồi lồng ghép và phương pháp nhận dạng độ dài đoạn phân cách (RFLP) để chứng minh độ đặc hiệu của thử nghiệm. Các đầu rễ ectomycorrhizal đơn lẻ cũng được phân tích tương tự. Các mồi này cũng đã được áp dụng thành công cho phân tích PCR định lượng (QPCR), PCR biến thiên độ dài (LH-PCR) và phương pháp T-RFLP (T-RFLP) cho nấm. Một bộ mồi đặc thù cho thực vật với phạm vi rộng đã được phát triển tại các vị trí tương ứng với một cặp mồi nấm. Những mồi này được sử dụng để xác minh rằng ADN cây chủ không được khuếch đại cùng với các mồi nấm.

Các mồi thực vật này đã được áp dụng thành công cho phân tích PCR-RFLP của các mô hình thực vật rừng từ các mẫu trên và dưới mặt đất và hoạt động tốt trong việc phân biệt một số lựa chọn của thực vật đến mức loài. Bộ mồi hoàn chỉnh đã được phát triển với sự nhấn mạnh vào việc phân biệt giữa các chuỗi thực vật và nấm, và sẽ đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu về nấm nơi mà các mẫu cũng chứa nhiều ADN thực vật nền, chẳng hạn như xác minh các kiểu hình ectomycorrhizal hoặc phân loại cộng đồng phylosphere.

Ve được coi là vector quan trọng nhất của các tác nhân gây bệnh ở động vật nuôi và động vật hoang dã. Ve bò, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, cản trở sản xuất gia súc ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi nó phát sinh. Hệ vi sinh vật của ve vẫn chưa được khám phá nhiều. Mục tiêu của nghiên cứu này là khám phá hệ vi sinh vật của R. microplus bằng cách áp dụng kỹ thuật giải trình tự amplicon pyrosequencing (bTEFAP) được mã hóa bởi thẻ 16S để xác định sự đa dạng vi khuẩn. Việc giải trình tự pyrosequencing được thực hiện trên các mẫu ve trưởng thành đực và cái, trứng, cùng với mô ruột và buồng trứng từ các cá thể cái trưởng thành lấy từ các mẫu R. microplus được thu thập trong các đợt bùng phát ở miền nam Texas.

Dữ liệu thô từ bTEFAP đã được sàng lọc và cắt tỉa dựa trên điểm chất lượng và nhóm vào các bộ mẫu cá nhân. Các loại vi khuẩn được xác định ở cấp độ loài bao gồm Staphylococcus aureus, Staphylococcus chromogenes, Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus sciuri, Serratia marcescens, Corynebacterium glutamicum, và Finegoldia magna. Một trăm hai mươi một chi vi khuẩn đã được phát hiện trong tất cả các giai đoạn sống và mô được lấy mẫu. Tổng số chi vi khuẩn được xác định từ các mẫu ve bao gồm: 53 trong mẫu đực trưởng thành, 61 trong mẫu cái trưởng thành, 11 trong mô ruột, 7 trong mô buồng trứng và 54 trong các tế bào trứng. Các chi vi khuẩn đáng chú ý được phát hiện trong ve bò bao gồm Wolbachia, Coxiella, và Borrelia. Phương pháp phân tử áp dụng trong nghiên cứu này đã cho phép chúng tôi đánh giá sự phong phú tương đối của hệ vi sinh vật gắn liền với R. microplus.

Báo cáo này đại diện cho khảo sát đầu tiên về hệ vi khuẩn trong ve bò sử dụng các phương pháp phân tử không dựa trên nuôi cấy. Việc so sánh kết quả của chúng tôi với các khảo sát vi khuẩn trước đó cung cấp một chỉ báo về sự biến đổi địa lý trong các tập hợp vi khuẩn liên quan đến R. microplus. Các báo cáo bổ sung về việc xác định các loài vi khuẩn mới được duy trì trong tự nhiên bởi R. microplus có thể gây bệnh cho các chủ ký sinh verterbrate sẽ được mong đợi khi hiểu biết của chúng tôi về hệ vi sinh vật của chúng mở rộng. Sự nhận thức ngày càng tăng về vai trò của R. microplus trong việc truyền các vi khuẩn gây bệnh sẽ nâng cao khả năng giảm thiểu tác động kinh tế của nó đối với nông nghiệp động vật toàn cầu. Nhận thức này cần được đưa vào trong các phân tích để đánh giá rủi ro tái xâm nhập của các khu vực như Hoa Kỳ nơi mà R. microplus đã bị tiêu diệt.

Nấm nội sinh được biết đến như là những ký sinh vật cộng sinh của cây trồng. Chúng sản xuất ra nhiều loại hợp chất có lợi cho sự phát triển và sinh tồn của cây, cũng như bảo vệ cây khỏi sự tấn công của một số loại tác nhân gây bệnh. Cồn cát ven biển thường thiếu hụt dinh dưỡng và cung cấp môi trường khắc nghiệt, mặn cho sự tồn tại của hệ thực vật và động vật. Nấm nội sinh có thể đóng vai trò quan trọng trong sự sống còn của cây bằng cách tăng cường việc hấp thụ dinh dưỡng và sản xuất ra các hợp chất kích thích sự phát triển như gibberellin và auxin. Chúng tôi đã sàng lọc rễ của Ixeris repenes (L.) A. Gray, một loại cây cồn cát phổ biến, để tách chiết nấm nội sinh tiết ra gibberellin.

Chúng tôi đã tách chiết 15 loại nấm nội sinh từ rễ của Ixeris repenes và sàng lọc chúng theo các hợp chất thứ cấp thúc đẩy sự phát triển. Đặc biệt, mẫu nấm IR-3-3 cho kết quả tăng trưởng cây tối đa khi được áp dụng cho giống lúa waitha-c và cây giống Atriplex gemelinii. Phân tích dịch lọc văn hóa của IR-3-3 cho thấy sự hiện diện của các gibberellin có hoạt tính sinh lý, GA₁, GA₃, GA₄ và GA₇ (1,95 ng/ml, 3,83 ng/ml, 6,03 ng/ml và 2,35 ng/ml, tương ứng) cùng với các gibberellin không có hoạt tính sinh lý khác như GA₅, GA₉, GA₁₂, GA₁₅, GA₁₉, GA₂₀ và GA₂₄. Khả năng thúc đẩy sự phát triển cây và sản xuất gibberellin của IR-3-3 cao hơn nhiều so với loại dại Gibberella fujikuroi, được sử dụng làm đối chứng trong nghiên cứu hiện tại. GA₅, một tiền chất của GA₃ có hoạt tính sinh học đã được báo cáo lần đầu tiên ở nấm. Mẫu nấm IR-3-3 được xác định là một chủng mới của Penicillium citrinum (được đặt tên là P. citrinum KACC43900) thông qua phân tích phát sinh chủng loài của trình tự 18S rDNA.

Sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, một dấu hiệu của nấm sợi, là một lĩnh vực nghiên cứu đang phát triển đối với Aspergilli. Những hợp chất này là những hóa chất mạnh, từ độc tố chết người cho đến kháng sinh điều trị và thuốc chống ung thư tiềm năng. Chuỗi gen của nhiều loài Aspergilli đã được xác định, cung cấp một kho thông tin dự đoán phong phú về sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp. Phân tích chuỗi và các chiến lược quá biểu hiện gen đã cho phép phát hiện các chất chuyển hóa thứ cấp mới và các gen liên quan đến quá trình tổng hợp của chúng. Cơ sở dữ liệu Genome của Aspergillus (AspGD) cung cấp một kho lưu trữ trung tâm cho việc chú thích gen và thông tin protein cho các loài Aspergillus. Những chú thích này bao gồm các thuật ngữ Gene Ontology (GO), dữ liệu hình thái, tên và mô tả gen và chúng rất quan trọng cho việc giải thích cả dữ liệu quy mô nhỏ và quy mô lớn cũng như hỗ trợ trong việc thiết kế các thí nghiệm mới nhằm thúc đẩy nghiên cứu Aspergillus.

Chúng tôi đã thực hiện việc chú thích GO cho các quá trình sinh học một cách thủ công cho tất cả các gen trong AspGD có chức năng ghi nhận trong sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, thêm các thuật ngữ GO mới cụ thể mô tả từng chất chuyển hóa thứ cấp. Chúng tôi sau đó đã tận dụng những chú thích mới này để dự đoán vai trò trong chuyển hóa thứ cấp cho những gen thiếu sự đặc trưng thực nghiệm. Là điểm khởi đầu cho việc chú thích thủ công các cụm gen chất chuyển hóa thứ cấp của Aspergillus, chúng tôi đã sử dụng các thuật toán antiSMASH (phân tích kháng sinh và chất chuyển hóa thứ cấp) và SMURF (tìm kiếm các vùng không xác định của chất chuyển hóa thứ cấp) để xác định các cụm tiềm năng trong A. nidulans, A. fumigatus, A. niger và A. oryzae, mà sau đó chúng tôi đã tinh chỉnh thông qua việc chú thích thủ công.

Nhiều chủng vi khuẩn đã được giải trình tự và chú thích bộ gen, các bộ gen này đã được sử dụng cùng với dữ liệu sinh hóa và sinh lý để tái cấu trúc các mạng lưới chuyển hóa quy mô gen. Việc tái cấu trúc này tương đương với việc chú thích hai chiều về bộ gen. Các mạng lưới này đã được phân tích thông qua một hình thức dựa trên ràng buộc, và nhiều kết quả có ý nghĩa sinh học đã xuất hiện. Staphylococcus aureus là một loại vi khuẩn gây bệnh đã phát triển khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, gây ra mối quan tâm lớn trong chăm sóc sức khỏe. Chúng tôi trình bày việc xây dựng mô hình tái cấu trúc và mô hình mạng lưới chuyển hóa quy mô gen duy nhất được quản lý thủ công của S. aureus và tính toán một số thuộc tính của nó.

Chúng tôi đã tái cấu trúc một mạng lưới chuyển hóa quy mô gen của chủng S. aureus N315. Việc tái cấu trúc này, được gọi là iSB619, bao gồm 619 gen xúc tác 640 phản ứng chuyển hóa. Đối với 91% các phản ứng, khung đọc mở (open reading frames) được liên kết một cách rõ ràng với các protein và phản ứng. Tất cả, ngoại trừ ba phản ứng chuyển hóa, đều được cân bằng về điện tích và nguyên tố. Danh sách phản ứng là đầy đủ nhất cho đến nay đối với loại vi khuẩn gây bệnh này. Khi khả năng của mạng lưới tái cấu trúc được phân tích trong bối cảnh tăng trưởng tối đa, chúng tôi hình thành các giả thuyết về yêu cầu tăng trưởng, hiệu quả tăng trưởng trên các nguồn carbon khác nhau, và các mục tiêu thuốc tiềm năng. Những giả thuyết này có thể được kiểm tra thực nghiệm và dữ liệu thu thập có thể được sử dụng để cải thiện các phiên bản tái cấu trúc tiếp theo.