Các mồi PCR đặc hiệu cho nấm được phát triển để phân tích vùng ITS của các mẫu ADN môi trường
Tóm tắt
Các vùng Spacer được liên lạc nội bộ (ITS) của ADN ribosome nấm (rDNA) là những chuỗi có tính biến đổi cao, có tầm quan trọng lớn trong việc phân biệt các loài nấm thông qua phân tích PCR. Các mồi PCR đã được công bố trước đây để khuếch đại các chuỗi này từ các mẫu môi trường cung cấp mức độ thành công khác nhau trong việc phân biệt ADN thực vật trong khi vẫn duy trì một phạm vi tương thích rộng. Thông thường, cần phải sử dụng nhiều bộ mồi khác nhau để phù hợp với các loài nấm đang nghiên cứu, có thể tạo ra sự phân biệt giả tạo đối với các chuỗi nấm khuếch đại với nhiều bộ mồi khác nhau.
Nhiều chuỗi cho các mồi PCR đã được thử nghiệm để phát triển các thử nghiệm PCR với một phạm vi tương thích nấm rộng và khả năng phân biệt cao khỏi ADN thực vật. Một bộ mồi lồng ghép gồm 4 mồi đã được phát triển phù hợp với những tiêu chí này và đã thực hiện tốt việc khuếch đại các vùng ITS của rDNA nấm. Các mồi trong chuỗi 5.8S cũng đã được phát triển cho phép khuếch đại riêng biệt các vùng ITS1 và ITS2. Một loạt các thân quả của lớp Basidiomycete và các nền văn hóa Ascomycete đã được phân tích với bộ mồi lồng ghép và phương pháp nhận dạng độ dài đoạn phân cách (RFLP) để chứng minh độ đặc hiệu của thử nghiệm. Các đầu rễ ectomycorrhizal đơn lẻ cũng được phân tích tương tự. Các mồi này cũng đã được áp dụng thành công cho phân tích PCR định lượng (QPCR), PCR biến thiên độ dài (LH-PCR) và phương pháp T-RFLP (T-RFLP) cho nấm. Một bộ mồi đặc thù cho thực vật với phạm vi rộng đã được phát triển tại các vị trí tương ứng với một cặp mồi nấm. Những mồi này được sử dụng để xác minh rằng ADN cây chủ không được khuếch đại cùng với các mồi nấm.
Các mồi thực vật này đã được áp dụng thành công cho phân tích PCR-RFLP của các mô hình thực vật rừng từ các mẫu trên và dưới mặt đất và hoạt động tốt trong việc phân biệt một số lựa chọn của thực vật đến mức loài. Bộ mồi hoàn chỉnh đã được phát triển với sự nhấn mạnh vào việc phân biệt giữa các chuỗi thực vật và nấm, và sẽ đặc biệt hữu ích cho các nghiên cứu về nấm nơi mà các mẫu cũng chứa nhiều ADN thực vật nền, chẳng hạn như xác minh các kiểu hình ectomycorrhizal hoặc phân loại cộng đồng phylosphere.
Từ khóa
Tài liệu tham khảo
Molina R, Caldwell BA, Castellano MA, Horton T, Smith JE: Mycorrhizae: Ectomycorrhizal fungi. Encyclopedia of Environmental Microbiology. Edited by: G Bitton. 2002, 2124-2132.
Horton TR, Bruns TD: The molecular revolution in ectomycorrhizal ecology: peeking into the black-box. Molecular Ecology. 2001, 10: 1855-1871. 10.1046/j.0962-1083.2001.01333.x.
Goodman DM, Trofymow JA: Distribution of ectomycorrhizas in micro-habitats in mature and old-growth stands of Douglas-fir on southeastern Vancouver Island. Soil Biol Biochem. 1998, 30: 2127-2138. 10.1016/S0038-0717(98)00094-7.
Taylor AFS: Fungal diversity in ectomycorrhizal communities: sampling effort and species detection. Plant Soil. 2002, 244: 19-28. 10.1023/A:1020279815472.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor JW: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Edited by: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. 1990, New York: Academic Press Inc, 315-322.
Gardes M, Bruns TD: ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes – application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol Ecol. 1993, 2: 113-118.
Gardes M, Fortin J, White TJ, Bruns TD, Taylor JW: Identification of indigenous and introduced symbiotic fungi in mycorrhizae by amplification of the internal transcribed spacer. Can J Bot. 1991, 69: 180-190.
Suzuki M, Rappé MS, Giovannoni SJ: Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl Environ Microbiol. 1998, 64: 4522-4529.
Landeweert R, Leeflang P, Kuyper TW, Hoffland E, Rosling A, Wernars K, Smit E: Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons. Appl Environ Microbiol. 2003, 69: 327-333. 10.1128/AEM.69.1.327-333.2003.
Liu W-T, Marsh TL, Cheng H, Forney LJ: Characterization of microbial diversity by determining Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of genes encoding 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 1997, 63: 4516-4522.
Marsh TL, Liu WT, Forney LJ, Cheng H: Beginning a molecular analysis of the eukaryal community in activated sludge. Water Science Technology. 1998, 37: 455-460. 10.1016/S0273-1223(98)00145-0.
Cole JR, Chai B, Marsh TL, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, Chandra S, McGarrell DM, Schmidt TM, Garrity GM, Tiedje JM: The Ribosomal Database Project (RDP-II): previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res. 2003, 31: 442-443. 10.1093/nar/gkg039.
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R: Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. BioTechnology. 1993, 11: 1026-1030. 10.1038/nbt0993-1026.
Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R: Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. BioTechnology. 1992, 10: 413-417. 10.1038/nbt0492-413.
Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT: Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the Polymerase Chain Reaction. Anal Biochem. 1997, 245: 154-160. 10.1006/abio.1996.9916.
Egger KN: Molecular analysis of ectomycorrhizal fungal communities. Can J Bot. 1994, S1415-S1422. Suppl 1
Malvárez G, Oliveira VL: A PCR/RFLP technique to characterize fungal species in Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden ectomycorrhizas. Mycorrhiza. 2003, 13: 101-105.
Shinohara ML, LoBuglio KF, Rogers SO: Group-I intron family in the nuclear ribosomal RNA small subunit genes of Cenococcum geophilum isolates. Curr Genet. 1996, 29: 377-387. 10.1007/s002940050059.
Egger KN, Osmond G, Goodier JL: Sequence and putative secondary structure of group I introns in the nuclear-encoded ribosomal RNA genes of the fungus Humenoscyphys ericae. Biochimica et Biophysica Acta. 1995, 1261: 275-278.
Martin KJ, Rygiewicz PT: Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. Agronomy Abstracts, Annual Meeting, American Society of Agronomy: Salt Lake City, UT. 1999
Burke D, Martin K, Rygiewicz P, Topa M: Characterization of Ectomycorrhizal Fungal Communities Using TRFLP. Soil Biol Biochem. 2005,
Martin KJ, Brooks RA, Phillips LL, Lepo JE: Combining real-time quantitative PCR with terminal restriction fragment length polymorphism methods to detect crop-bioterrorism agents. Agronomy Abstracts, American Society of Agronomy: Denver, CO. 2003
Gargas A, DePriest PT: A nomenclature for fungal PCR primers with examples from intron-containing SSU rDNA. Mycologia. 1996, 88: 745-748.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680.
Kulikova T, Aldebert P, Althorpe N, Baker W, Bates K, Browne P, van den Broek A, Cochrane G, Duggan K, Eberhardt R, Faruque N, Garcia-Pastor M, Harte N, Kanz C, Leinonen R, Lin Q, Lombard V, Lopez R, Mancuso R, McHale M, Nardone F, Silventoinen V, Stoehr P, Stoesser G, Tuli MA, Tzouvara K, Vaughan R, Wu D, Zhu W, Apweiler R: The EMBL Nucleotide Sequence Database. Nucleic Acids Res. 2004, 32: D27-D30. 10.1093/nar/gkh120.
King AD, Hocking AD, Pitt JI: Dichloran-rose Bengal medium for enumeration and isolation of molds from foods. Appl Environ Microbiol. 1979, 37: 959-996.
Pitt J: A Laboratory Guide to the Common Penicillium Species. 1988, North Ryde, NSW: CSIRO
Carmichael JW, Kendrick WB, Conners IL, Sigler L: Genera of Hyphomycetes. 1980, Edmonton: University of Alberta Press
Domsch KH, Gams W, Anderson T-H: Compendium of Soil Fungi. (Reprint with Supplements.). 1993, New York: Academic Press
Nelson PE, Toussoun TA, Marasas WFO: Fusarium Species: an Illustrated Manual for Identification. 1983, University Park: Penn. State University Press
Arora D: Mushrooms Demystified: A Comprehensive Guide to the Fleshy Fungi. 1986, Berkeley: Ten Speed Press
Smith AH: A Field Guide to Western Mushrooms. 1975, Ann Arbor: University of Michigan Press
Rygiewicz PT, Martin KJ, Tuininga AR: Morphological diversity of ectomycorrhizas on Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii Mirb. Franco) seedlings grown under elevated atmospheric CO2 and temperature. Oecologia. 2000, 124: 299-308. 10.1007/s004420000385.
Baker DD, Mullin B: Diversity of Frankia nodule endophytes of the actinorhizal shrub Ceanothus as assessed by RFLP patterns from single nodule lobes. Soil Biol Biochem. 1994, 26: 547-552. 10.1016/0038-0717(94)90241-0.
Ross IK: Non-grinding method of DNA isolation from human pathogenic filamentous fungi using xanthogenates. BioTechniques. 1995, 18: 828-830.
Jhingan AK: A novel technology for DNA isolation. Methods Mol Cell Biol. 1992, 3: 15-22.
Ioannou YA, Chen FW: Quantitation of DNA fragmentation in apoptosis. Nucleic Acids Res. 1996, 24: 992-3. 10.1093/nar/24.5.992.
van de Peer Y, De Wachter R: TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Applic Biosci. 1994, 10: 569-570.
Link W, Dixens C, Singh M, Schwall M, Melchinger AE: Genetic diversity in European and Mediterranean faba bean germ plasm revealed by RAPD markers. Theor Appl Genet. 1995, 90: 27-32. 10.1007/BF00220992.