Applied and Environmental Microbiology

mothur nhắm đến mục tiêu trở thành một gói phần mềm toàn diện cho phép người dùng sử dụng một phần mềm duy nhất để phân tích dữ liệu chuỗi cộng đồng. Phần mềm này xây dựng dựa trên các công cụ trước đó để cung cấp một gói phần mềm linh hoạt và mạnh mẽ cho việc phân tích dữ liệu giải trình tự. Như một nghiên cứu điển hình, chúng tôi đã sử dụng mothur để cắt, sàng lọc và căn chỉnh các chuỗi; tính toán khoảng cách; gán các chuỗi vào các đơn vị phân loại hoạt động; và mô tả sự đa dạng α và β của tám mẫu biển trước đây được xác định bằng cách giải trình tự pyrosequencing các đoạn gen 16S rRNA. Phân tích hơn 222.000 chuỗi này đã được hoàn thành trong chưa đầy 2 giờ với một máy tính xách tay.

Dự án Cơ Sở Dữ Liệu Ribosome (RDP) với bộ phân loại Bayesian đơn giản có thể nhanh chóng và chính xác phân loại các trình tự 16S rRNA của vi khuẩn vào hệ thống phân loại cấp cao hơn mới được đề xuất trong Bản phác thảo phân loại vi khuẩn của Bergey (Ấn bản thứ 2, phát hành 5.0, Springer-Verlag, New York, NY, 2004). Nó cung cấp các phân công phân loại từ miền xuống chi, với ước tính độ tin cậy cho mỗi gán. Phần lớn các phân loại (98%) có độ tin cậy ước tính cao (≥95%) và độ chính xác cao (98%). Ngoài việc được kiểm tra với tập hợp gồm 5,014 chuỗi chủng kiểu từ bản phác thảo của Bergey, bộ phân loại RDP đã được kiểm tra với tập hợp 23,095 trình tự rRNA được phân chia bởi NCBI vào hệ thống phân loại cấp cao hơn thay thế. Kết quả từ các thử nghiệm bỏ đi một lần trên cả hai tập hợp cho thấy rằng độ chính xác tổng thể ở mọi cấp độ tin cậy cho các đoạn gần hoàn chỉnh và đoạn dài 400 base là từ 89% trở lên xuống đến cấp chi, và phần lớn lỗi phân loại dường như do sự bất thường trong các hệ thống phân loại hiện tại. Đối với các đoạn rRNA ngắn hơn, chẳng hạn như những đoạn có thể được tạo ra bằng phương pháp pyrosequencing, tỷ lệ lỗi thay đổi lớn trên chiều dài của gene 16S rRNA, với các đoạn quanh các vùng biến V2 và V4 cho tỷ lệ lỗi thấp nhất. Bộ phân loại RDP phù hợp cho cả phân tích trình tự rRNA đơn lẫn phân tích các thư viện chứa hàng nghìn trình tự. Một công cụ liên quan khác, RDP Library Compare, đã được phát triển để tạo điều kiện so sánh cộng đồng vi sinh vật dựa trên các thư viện chuỗi gene 16S rRNA. Nó kết hợp bộ phân loại RDP với một bài kiểm tra thống kê để đánh dấu các taxon được biểu hiện khác nhau giữa các mẫu. Bộ phân loại RDP và RDP Library Compare đều có sẵn trực tuyến tại http://rdp.cme.msu.edu/ .

Chúng tôi mô tả một phương pháp phân tử mới để phân tích đa dạng di truyền của các quần thể vi sinh vật phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên việc tách biệt các đoạn gene mã hóa cho 16S rRNA, có cùng chiều dài, được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua điện di gel gradient biến tính (DGGE). Phân tích DGGE của các cộng đồng vi sinh vật khác nhau cho thấy sự hiện diện của tối đa 10 băng phân biệt trong mẫu tách, nhiều khả năng đến từ nhiều loài khác nhau cấu thành các quần thể này, và do đó tạo ra một hồ sơ DGGE của các quần thể đó. Chúng tôi đã chỉ ra rằng có thể xác định các thành phần chỉ chiếm 1% tổng số quần thể. Với một probe oligonucleotide đặc hiệu cho vùng V3 của 16S rRNA của vi khuẩn khử sulfate, một số đoạn DNA cụ thể từ một số quần thể vi sinh vật có thể được xác định thông qua phân tích lai ghép. Phân tích DNA gen của một màng sinh học vi khuẩn phát triển dưới điều kiện hiếu khí cho thấy rằng vi khuẩn khử sulfate, bất chấp tính kỵ khí của chúng, vẫn hiện diện trong môi trường này. Các kết quả mà chúng tôi thu được chứng tỏ rằng kỹ thuật này sẽ góp phần vào việc hiểu biết về đa dạng di truyền của các quần thể vi sinh vật chưa được mô tả.

Cơ sở dữ liệu gen 16S rRNA ( http://greengenes.lbl.gov ) giải quyết những hạn chế của các kho dữ liệu công cộng bằng cách cung cấp kiểm tra chimera, căn chỉnh chuẩn và phân loại thuế bằng nhiều phân loại đã được công bố. Đã phát hiện ra rằng có sự không nhất quán trong thuật ngữ phân loại giữa các người quản lý ngay cả ở cấp độ ngành. Các chimera có khả năng đã được xác định trong 3% các trình tự môi trường và trong 0.2% các bản ghi từ các mẫu đơn lập. Các trình tự môi trường đã được phân loại thành 100 dòng giống cấp ngành trong Archaea và Bacteria .

Chúng tôi giới thiệu một phương pháp mới để tính toán sự khác biệt giữa các cộng đồng vi khuẩn dựa trên thông tin phân giác. Phương pháp này, UniFrac, đo khoảng cách phân giác giữa các tập hợp thuế đóng trong một cây phân giác, thể hiện như một phần của chiều dài nhánh của cây dẫn đến các hậu duệ từ một môi trường này hoặc môi trường khác, nhưng không phải cả hai. UniFrac có thể được sử dụng để xác định xem các cộng đồng có khác biệt đáng kể hay không, để so sánh nhiều cộng đồng cùng một lúc bằng cách sử dụng các kỹ thuật phân nhóm và bố trí, và để đo lường đóng góp tương đối của các yếu tố khác nhau, chẳng hạn như hóa học và địa lý, vào sự tương đồng giữa các mẫu. Chúng tôi chứng minh tính hữu ích của UniFrac bằng cách áp dụng nó vào các thư viện gen 16S rRNA đã được công bố từ các mẫu nuôi cấy và các bản sao môi trường của vi khuẩn trong trầm tích biển, nước và băng. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng (i) các mẫu nuôi cấy từ băng, nước và trầm tích có sự tương đồng với nhau và với các chuỗi bản sao môi trường từ băng biển, nhưng không với các chuỗi bản sao môi trường từ trầm tích và nước; (ii) vị trí địa lý không có mối tương quan mạnh với sự khác biệt của cộng đồng vi khuẩn trong băng và trầm tích từ khu vực Bắc Cực và Nam Cực; và (iii) các cộng đồng vi khuẩn khác nhau giữa nước biển chịu ảnh hưởng đất liền (dù ở vùng cực hay ôn hòa) và nước biển oligotrophic ấm, trong khi những mẫu nước biển riêng lẻ không tương đồng nhiều hơn với nhau so với các mẫu trầm tích hay băng. Những kết quả này minh họa rằng UniFrac cung cấp một cách mới để mô tả các cộng đồng vi khuẩn, sử dụng sự phong phú của các chuỗi rRNA môi trường, và cho phép cái nhìn định lượng về các yếu tố nền tảng phân bố các dòng tộc giữa các môi trường.

Sự tiến bộ nhanh chóng trong công nghệ giải trình đã thay đổi cảnh quan thực nghiệm của sinh thái vi sinh vật. Trong 10 năm qua, lĩnh vực này đã chuyển từ việc giải trình hàng trăm đoạn gen 16S rRNA mỗi nghiên cứu thông qua thư viện nhân bản sang việc giải trình hàng triệu đoạn mỗi nghiên cứu bằng các công nghệ giải trình thế hệ tiếp theo từ 454 và Illumina. Khi những công nghệ này tiến bộ, việc đánh giá sức mạnh, điểm yếu và độ phù hợp tổng thể của các nền tảng này để thẩm vấn các cộng đồng vi sinh vật là điều rất quan trọng. Tại đây, chúng tôi trình bày một phương pháp cải tiến để giải trình các vùng biến đổi trong gen 16S rRNA bằng nền tảng MiSeq của Illumina, nền tảng hiện có thể tạo ra các đoạn đọc 250 nucleotide cặp. Chúng tôi đã đánh giá ba vùng chồng lấp của gen 16S rRNA có độ dài khác nhau (tức là, V34, V4 và V45) bằng cách giải trình lại một cộng đồng giả mẫu và các mẫu tự nhiên từ phân người, phân chuột và đất. Bằng cách điều chỉnh nồng độ các amplicon gen 16S rRNA được áp dụng vào ô dòng và sử dụng phương pháp dựa trên điểm chất lượng để sửa chữa những chênh lệch giữa các đoạn đọc được sử dụng để xây dựng contig, chúng tôi đã có thể giảm tỷ lệ lỗi tới hai bậc độ lớn. Cuối cùng, chúng tôi đã xử lý lại các mẫu từ một nghiên cứu trước đây để chứng minh rằng một số lượng lớn mẫu có thể được đa tuyến và giải trình cùng một lúc với shotgun metagenomes. Các phân tích này cho thấy rằng phương pháp của chúng tôi có thể cung cấp dữ liệu ít nhất cũng tốt như dữ liệu được tạo ra bởi nền tảng 454 trong khi cung cấp độ phủ giải trình cao hơn đáng kể với chỉ một phần chi phí.

Màng lọc Nuclepore polycarbonate có ưu thế hơn màng lọc cellulose trong việc đếm trực tiếp vi khuẩn vì chúng có kích thước lỗ đồng nhất và bề mặt phẳng giữ tất cả vi khuẩn ở trên bề mặt màng. Trong khi màng lọc cellulose cũng giữ tất cả vi khuẩn, nhiều vi khuẩn bị lọt vào bên trong màng, nơi không thể đếm được. Trước khi sử dụng, màng lọc Nuclepore phải được nhuộm màu với irgalan black để loại bỏ hiện tượng tự phát huỳnh quang. Số lượng vi khuẩn đếm được trực tiếp trong nước hồ và nước biển cao gấp đôi khi sử dụng màng Nuclepore so với màng lọc cellulose.

Nhiều hàm sigmoid (logistic, Gompertz, Richards, Schnute và Stannard) đã được so sánh để mô tả đường cong tăng trưởng của vi khuẩn. Chúng được so sánh một cách thống kê bằng cách sử dụng mô hình của Schnute, là một mô hình toàn diện, bao gồm tất cả các mô hình khác. Phép thử t và phép thử F đã được sử dụng. Với phép thử t, khoảng tin cậy cho các tham số có thể được tính toán và có thể được sử dụng để phân biệt giữa các mô hình. Trong phép thử F, mức độ khớp của các mô hình được so sánh với sai số đo. Hơn nữa, các mô hình được so sánh về mặt dễ sử dụng. Tất cả các hàm sigmoid đã được điều chỉnh để chứa các tham số sinh học liên quan. Các mô hình của Richards, Schnute và Stannard dường như về cơ bản là cùng một phương trình. Trong các trường hợp được kiểm tra, phương trình Gompertz đã được điều chỉnh thống kê là đủ để mô tả dữ liệu tăng trưởng của Lactobacillus plantarum và dễ sử dụng.

Chúng tôi đã xây dựng chín bộ mồi oligonucleotide dựa trên kết quả lai DNA của các gen đã nhân bản từ Neurospora crassa và Aspergillus nidulans với các hệ gen của một số ascomycetes sợi và deuteromycetes (có quan hệ với ascomycete sợi). Chín bộ mồi đã được thiết kế để khuếch đại các đoạn DNA có chứa một hoặc nhiều intron trong các gen bảo tồn. Việc khuếch đại DNA bằng PCR với chín bộ mồi này kết hợp với DNA toàn thể từ các ascomycetes, deuteromycetes, basidiomycetes và thực vật đã cho thấy rằng năm trong số các bộ mồi này chỉ khuếch đại sản phẩm từ DNA của các ascomycetes sợi và deuteromycetes. Năm bộ mồi này được xây dựng từ các gen của N. crassa cho histone 3, histone 4, beta-tubulin và ATPase màng plasma. Với năm bộ mồi này, đã quan sát thấy các biến thể ở cả kích thước và vị trí enzyme giới hạn trong các sản phẩm khuếch đại từ các ascomycetes sợi. Các bộ mồi được mô tả ở đây có thể cung cấp các công cụ hữu ích cho các nghiên cứu phát sinh loài và phân tích hệ gen trong các ascomycetes sợi và deuteromycetes (có quan hệ với ascomycete), cũng như cho việc phân biệt nhanh chóng các loài nấm bằng PCR.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra các đặc tính kháng khuẩn của các hạt nano bạc có hình dạng khác nhau chống lại vi khuẩn gram âm Escherichia coli , cả trong hệ thống lỏng và trên đĩa thạch. Hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua lọc năng lượng cho thấy sự thay đổi đáng kể trong màng tế bào sau khi xử lý, dẫn đến cái chết của tế bào. Các tấm nanobạc tam giác cụt với mặt phẳng mạng {111} làm mặt phẳng cơ bản thể hiện tác động tiêu diệt sinh học mạnh nhất, so với các hạt nano hình cầu và hình que và với Ag ⁺ (dưới dạng AgNO ₃ ). Đề xuất rằng kích thước nano và sự xuất hiện của mặt phẳng {111} kết hợp để thúc đẩy thuộc tính tiêu diệt sinh vật này. Theo chúng tôi biết, đây là nghiên cứu so sánh đầu tiên về tính chất diệt khuẩn của các hạt nano bạc có hình dạng khác nhau, và các kết quả của chúng tôi chứng minh rằng các hạt nano bạc tương tác phụ thuộc vào hình dạng với vi khuẩn gram âm E. coli .