Antimicrobial Agents and Chemotherapy

Trong công trình này, chúng tôi đã thiết kế và phát triển hai công cụ Web dễ sử dụng cho phép tính toán trong môi trường máy tính phát hiện và xác định đặc điểm của chuỗi gen toàn bộ bộ gen (WGS) và dữ liệu chuỗi toàn bộ plasmid từ các thành viên của họ Enterobacteriaceae . Các công cụ này sẽ giúp cho việc định kiểu khuẩn dựa trên bản nháp của bộ gen của các loài đa kháng thuốc thuộc họ Enterobacteriaceae bằng cách phát hiện nhanh chóng các loại plasmid đã biết. Các chuỗi replicon từ 559 plasmid đã được giải mã toàn bộ liên quan đến họ Enterobacteriaceae trong cơ sở dữ liệu nucleotide của NCBI đã được thu thập để tạo cơ sở dữ liệu đồng thuận tích hợp vào công cụ Web gọi là PlasmidFinder, có thể được dùng để phân tích trình tự replicon từ dữ liệu trình tự plasmid thô, nhóm contig, hoặc được lắp ráp hoàn chỉnh và đóng gói. Cơ sở dữ liệu PlasmidFinder hiện bao gồm 116 chuỗi replicon phù hợp với ít nhất 80% độ tương đồng nucleotide với tất cả các chuỗi replicon được xác định trong 559 plasmid đã được giải mã toàn bộ. Đối với phân tích Đa Vị trí Trình tự Plasmid (pMLST), một cơ sở dữ liệu được cập nhật hàng tuần đã được tạo ra từ www.pubmlst.org và được tích hợp vào một công cụ Web gọi là pMLST. Cả hai cơ sở dữ liệu đã được đánh giá bằng cách sử dụng các bộ gen nháp từ một bộ sưu tập của các chủng Salmonella enterica serovar Typhimurium. PlasmidFinder đã xác định tổng cộng 103 replicon và từ không đến năm replicon trong mỗi bộ gen nháp của S . Typhimurium đã được thử nghiệm. Công cụ web pMLST đã có thể xác định phân nhóm dữ liệu trình tự gen của plasmid, tiết lộ cả các loại trình tự plasmid đã biết (STs) và các alen mới cũng như các biến thể ST. Kết luận, thử nghiệm của hai công cụ Web này sử dụng cả trình tự plasmid lắp ráp hoàn chỉnh và các bộ gen nháp tạo ra từ WGS cho thấy khả năng phát hiện một loạt các loại plasmid thường liên quan đến kháng kháng sinh trong các tác nhân gây bệnh vi khuẩn có ý nghĩa lâm sàng.

Hiện nay, có hai hệ thống phân loại cho β-lactamase đang được sử dụng. Phân loại phân tử dựa vào chuỗi axit amin và chia β-lactamase thành các enzym lớp A, C và D sử dụng serine cho quá trình thủy phân β-lactam, và các metalloenzym lớp B cần ion kẽm hai hóa trị cho quá trình thủy phân cơ chất. Hệ thống phân loại chức năng được cập nhật trong tài liệu này dựa trên đề xuất năm 1995 của Bush và các cộng sự (K. Bush, G. A. Jacoby, và A. A. Medeiros, Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233, 1995). Hệ thống này xem xét các hồ sơ cơ chất và chất ức chế nhằm mục đích nhóm các enzym theo cách có thể liên quan đến kiểu hình của chúng trong các chủng cách ly lâm sàng. Các nhóm chính thường tương quan với phân loại phân tử cơ bản hơn. Hệ thống đã được cập nhật bao gồm nhóm 1 (lớp C) cephalosporinases; nhóm 2 (các lớp A và D) β-lactamase phổ rộng, chịu ức chế, và β-lactamase phổ mở rộng cùng với carbapenemases chứa serine; và nhóm 3 metallo-β-lactamases. Nhiều tiểu nhóm mới cho mỗi nhóm chính được mô tả, dựa trên các đặc điểm cụ thể của các enzym riêng lẻ. Một danh sách các thuộc tính cũng được đề xuất để mô tả một β-lactamase mới, bao gồm các thuộc tính vi sinh vật cần thiết, hồ sơ cơ chất và chất ức chế, cùng với dữ liệu chuỗi phân tử cung cấp đặc điểm đầy đủ cho một enzym thủy phân β-lactam mới.

Lĩnh vực khám phá thuốc kháng sinh và theo dõi các yếu tố kháng kháng sinh mới chưa khai thác đầy đủ sức mạnh của cuộc cách mạng về gen. Mặc dù bộ gen đầu tiên được giải mã của các sinh vật sống tự do là của vi khuẩn, nhưng vẫn còn rất ít công cụ sinh tin học chuyên biệt được phát triển để khai thác khối lượng dữ liệu gen ngày càng tăng liên quan đến các tác nhân gây bệnh. Đặc biệt, có rất ít công cụ để nghiên cứu di truyền và gen của kháng kháng sinh cùng với cách mà chúng ảnh hưởng đến quần thể vi khuẩn, sinh thái và lâm sàng. Chúng tôi đã bắt đầu phát triển các công cụ như vậy dưới hình thức Cơ sở dữ liệu Nghiên cứu Kháng thuốc Kháng sinh Toàn diện (CARD; http://arpcard.mcmaster.ca ). CARD tích hợp các dữ liệu phân tử và chuỗi khác nhau, cung cấp một nguyên tắc tổ chức độc đáo dưới hình thức Ontology Kháng kháng sinh (ARO), và có thể nhanh chóng xác định các gen kháng kháng sinh khả dĩ trong các chuỗi gen chưa được chú thích mới. Nền tảng độc đáo này cung cấp một công cụ tin học kết nối các lo ngại về kháng kháng sinh trong chăm sóc sức khỏe, nông nghiệp và môi trường.

Peptit tổng hợp T-20 (enfuvirtide) đại diện cho loại thuốc kháng retrovirus mới đầu tiên cho thấy hiệu lực in vivo bằng cách nhắm vào một bước trong quá trình xâm nhập của virus. T-20 ức chế sự thay đổi cấu hình trong glycoprotein xuyên màng HIV-1 loại 1 (gp41) của virus HIV, sự thay đổi này là cần thiết cho sự hợp nhất giữa HIV-1 và màng tế bào mục tiêu. Giai đoạn thử nghiệm lâm sàng phase I đầu tiên của điều trị T-20 cho bệnh nhân nhiễm HIV đã cung cấp một cơ hội độc đáo để đánh giá sự xuất hiện của virus kháng thuốc in vivo đối với loại thuốc kháng retrovirus mới này. Tất cả bốn bệnh nhân được nhận một liều trung bình T-20 (30 mg hai lần mỗi ngày) đều có sự giảm đáng kể trong tải lượng virus huyết tương trong 10 ngày đầu nhưng có xu hướng tăng lên vào ngày thứ 14, cho thấy có sự chọn lọc cho virus kháng. Virus huyết tương được thu thập từ bệnh nhân tham gia vào tất cả các nhóm liều lượng trong thử nghiệm phase I T-20 đã được phân tích bằng phương pháp giải trình tự quần thể trước và sau điều trị. Mặc dù không có đột biến nào được phát hiện trong một chuỗi 3 axit amin rất bảo tồn (GIV) được biết là quan trọng cho sự hợp nhất tại cơ sở, sau 14 ngày điều trị, virus từ một bệnh nhân trong nhóm liều 30 mg (30-1) đã phát triển một đột biến trong motif này, cụ thể là sự thay thế axit aspartic (D) cho glycine (G) tại vị trí 36. Nhiều dòng env đã được thu nhận từ virus huyết tương của cả bốn bệnh nhân trong nhóm liều 30 mg. Phân tích chuỗi của 49 dòng thu được từ huyết tương của bệnh nhân 30-1 vào ngày thứ 14 cho thấy 25 dòng chứa đột biến G36D, trong khi 8 dòng chứa đột biến V38A. Các đột biến kép liên quan đến G36D và các chất khác trong miền HR1 cũng đã được xác định. Trong 5 trong số 49 dòng env, các đột biến khác liên quan đến các phần tử 32 (Q32R hoặc Q32H) và 39 (Q39R) đã được phát hiện kết hợp với G36D. Các chuỗi env đã được nhân bản từ virus huyết tương của chủ thể 30-3 cũng có các đột biến đơn trong chuỗi GIV (V38M và I37V) có thể phát hiện được sau khi điều trị bằng T-20. Virus huyết tương từ các chủ thể 30-2 và 30-4 không chứa những thay đổi trong chuỗi GIV. Để phân tích các thuộc tính kháng sinh sinh học của những đột biến này, chúng tôi đã phát triển một thử nghiệm xâm nhập HIV-1 một vòng mới sử dụng tế bào JC53BL, tế bào này thể hiện β-galactosidase và luciferase dưới sự kiểm soát của HIV-1 long terminal repeat. Các dòng env đầy đủ đã được thu nhận từ virus huyết tương của bệnh nhân 30-1 và 30-3 và được sử dụng để tạo ra các stock virus giả. Nồng độ ức chế 50% trung bình (IC ₅₀ ) cho các đột biến G36D và V38A (bệnh nhân 30-1) lần lượt là 2.3 μg/ml và 11.2 μg/ml, có sự tăng đáng kể 9.1- và 45 lần, so với loại hoang dã. IC ₅₀ cho đột biến V38 M (bệnh nhân 30-3) là 7.6 μg/ml, một sự tăng 8 lần so với loại hoang dã. Đột biến I37V dẫn đến một IC ₅₀ lớn gấp 3.2 lần so với loại hoang dã. Các Envs với các đột biến kép (Q32R cộng với G36D và Q32H cộng với G36D) thể hiện mức độ kháng tương tự như G36D một mình. Những phát hiện này cung cấp bằng chứng đầu tiên cho sự xuất hiện nhanh chóng của kháng lâm sàng đối với một loại thuốc ức chế xâm nhập HIV-1 mới và có thể có liên quan đến các chiến lược điều trị trong tương lai liên quan đến các tác nhân này.

Việc đặc trưng đầy đủ vi khuẩn kháng methicillin Staphylococcus aureus (MRSA) không chỉ yêu cầu xác định nền gen vi khuẩn mà còn cả cấu trúc của yếu tố phức tạp và dị hợp tử mec mà các vi khuẩn này mang, yếu tố này liên quan đến gen xác định tính kháng thuốc mecA. Chúng tôi báo cáo về sự phát triển, xác thực và ứng dụng của một chiến lược PCR đa mảnh cho phép đặc trưng sơ bộ nhanh chóng các loại yếu tố mec dựa trên các đặc điểm cấu trúc đã được chứng minh là điển hình của các yếu tố mec mang bởi nhiều chủng MRSA. Chiến lược này đã được xác thực bằng cách sử dụng một bộ sưu tập đại diện của các chủng MRSA đại dịch, trong đó đầy đủ cấu trúc của các yếu tố mec liên quan đã được xác định trước đó bằng cách lai ghép và sàng lọc PCR cũng như bằng phương pháp giải trình tự DNA. Phương pháp này đã được kiểm tra cùng với phương pháp phân loại theo nhiều locus và các phương pháp phân loại khác để đặc trưng hóa 18 mẫu đại diện cho các chủng MRSA thu thập được trong một đợt bùng phát tại bệnh viện ở Barcelona, Tây Ban Nha. PCR đa mảnh đã được chứng minh là nhanh chóng, đáng tin cậy, và có khả năng trong một thử nghiệm xác định năm loại cấu trúc của yếu tố mec giữa các chủng này, ba biến thể chính và hai biến thể phụ, mỗi loại đều đã được phát hiện trong các nghiên cứu kháng MRSA trước đây. Kỹ thuật này có thể là một bổ sung hữu ích cho kho vũ khí các công cụ phân loại phân tử dùng cho việc đặc trưng các loại clonal MRSA và nhận diện nhanh chóng các biến thể cấu trúc của yếu tố mec.

ARG-ANNOT (Chú Thích Gene Kháng Kháng Sinh) là một công cụ tin sinh học mới được phát triển để phát hiện các gene kháng kháng sinh (AR) đã biết và tiềm tàng mới trong bộ gen của vi khuẩn. ARG-ANNOT sử dụng một chương trình BLAST cục bộ trong phần mềm Bio-Edit cho phép người dùng phân tích các chuỗi mà không cần giao diện Web. Tất cả các yếu tố di truyền AR đã được thu thập từ các công trình đã công bố và các nguồn tài nguyên trực tuyến; các chuỗi nucleotide và protein đã được truy xuất từ cơ sở dữ liệu NCBI GenBank. Sau khi xây dựng một cơ sở dữ liệu bao gồm 1,689 gene kháng kháng sinh, phần mềm này đã được thử nghiệm một cách mù bằng cách sử dụng 100 chuỗi ngẫu nhiên được chọn từ cơ sở dữ liệu nhằm xác minh rằng độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% ngay cả khi có các chuỗi phần. Đặc biệt, kết quả phân tích BLAST thu được bằng cách sử dụng chuỗi gene rmtF (một chuỗi gene enzyme biến đổi aminoglycoside mới không có trong cơ sở dữ liệu) làm truy vấn cho thấy công cụ này có khả năng liên kết chuỗi này với các chuỗi ngắn (17 đến 40 bp) tìm thấy trong các gene khác thuộc họ rmt với các giá trị E có ý nghĩa. Cuối cùng, việc phân tích 178 Acinetobacter baumannii và 20 Staphylococcus aureus cho phép phát hiện số lượng gene AR cao hơn đáng kể so với bộ phân tích gene Resfinder và 11 đột biến điểm trong các gene mục tiêu được biết đến có liên quan đến AR. Thời gian trung bình để phân tích một bộ gen là 3.35 ± 0.13 phút. Chúng tôi đã tạo ra một cơ sở dữ liệu ngắn gọn cho BLAST sử dụng giao diện Bio-Edit có thể phát hiện các yếu tố di truyền AR trong bộ gen của vi khuẩn và có thể nhanh chóng và dễ dàng khám phá các yếu tố di truyền AR mới tiềm tàng.

Trong bài tổng quan này, chúng tôi tóm tắt “trạng thái nghệ thuật” hiện tại của kháng sinh carbapenem và vai trò của chúng trong kho vũ khí kháng khuẩn của chúng ta. Trong số các β-lactam hiện có, carbapenem là độc nhất vì chúng tương đối bền vững trước sự thủy phân của hầu hết các β-lactamase, trong một số trường hợp hoạt động như “cơ chất chậm” hoặc chất ức chế β-lactamase, và vẫn nhắm mục tiêu các protein liên kết penicillin. Tính năng “gia tăng giá trị” này trong việc ức chế β-lactamase là lý do chính cho sự mở rộng của nhóm β-lactam này. Chúng tôi mô tả phát hiện ban đầu và sự phát triển của dòng họ carbapenem của các β-lactam. Trong số các carbapenem sớm được đánh giá, thienamycin đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất và trở thành hợp chất gốc cho tất cả các carbapenem tiếp theo. Cho đến nay, có hơn 80 hợp chất với các đặc tính kháng khuẩn cải thiện chủ yếu, so với thienamycin, được mô tả trong tài liệu. Chúng tôi cũng nhấn mạnh các tính năng quan trọng của các carbapenem hiện đang được sử dụng lâm sàng: imipenem-cilastatin, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem-betamipron, và biapenem. Cuối cùng, chúng tôi nhấn mạnh một số thách thức lớn và kêu gọi các nhà hóa học dược liệu tiếp tục phát triển các hợp chất linh hoạt và mạnh mẽ này, vì chúng đã phục vụ chúng ta tốt trong hơn 3 thập kỷ qua.