Springer Science and Business Media LLC

Abstract Background As real-time quantitative PCR (RT-QPCR) is increasingly being relied upon for the enforcement of legislation and regulations dependent upon the trace detection of DNA, focus has increased on the quality issues related to the technique. Recent work has focused on the identification of factors that contribute towards significant measurement uncertainty in the real-time quantitative PCR technique, through investigation of the experimental design and operating procedure. However, measurement uncertainty contributions made during the data analysis procedure have not been studied in detail. This paper presents two additional approaches for standardising data analysis through the novel application of statistical methods to RT-QPCR, in order to minimise potential uncertainty in results. Results Experimental data was generated in order to develop the two aspects of data handling and analysis that can contribute towards measurement uncertainty in results. This paper describes preliminary aspects in standardising data through the application of statistical techniques to the area of RT-QPCR. The first aspect concerns the statistical identification and subsequent handling of outlying values arising from RT-QPCR, and discusses the implementation of ISO guidelines in relation to acceptance or rejection of outlying values. The second aspect relates to the development of an objective statistical test for the comparison of calibration curves. Conclusion The preliminary statistical tests for outlying values and comparisons between calibration curves can be applied using basic functions found in standard spreadsheet software. These two aspects emphasise that the comparability of results arising from RT-QPCR needs further refinement and development at the data-handling phase. The implementation of standardised approaches to data analysis should further help minimise variation due to subjective judgements. The aspects described in this paper will help contribute towards the development of a set of best practice guidelines regarding standardising handling and interpretation of data arising from RT-QPCR experiments.

Tóm tắt Giới thiệu Cào cào là một hệ mô hình quan trọng trong thần kinh học, phát triển và tiến hóa. Các đại diện của nhóm côn trùng nguyên thủy này cũng là mục tiêu rất quan trọng trong nỗ lực kiểm soát dịch hại. Đáng tiếc rằng việc thiếu công nghệ di truyền hoặc can thiệp phân tử cụ thể về gen đã đặt ra rất nhiều hạn chế cho việc nghiên cứu sinh học của cào cào. Kết quả Chúng tôi đã nghiên cứu xem liệu các giai đoạn ấu trùng của loài cào cào Schistocerca americana có thuận lợi cho việc làm giảm biểu hiện gen thông qua đường đi RNAi toàn thân hay không. Tiêm dsRNA tương ứng với gen màu mắt vermilion vào các ấu trùng giai đoạn đầu tiên đã kích thích sự ức chế hình thành ommochrome trong mắt kéo dài qua hai giai đoạn tương đương với 10–14 ngày theo thời gian thực tế. Phân tích QRT-PCR cho thấy mức độ bản sao mục tiêu đã giảm xuống một nửa ở các cá thể bị ảnh hưởng. Các tiêm điều khiển bằng EGFP dsRNA không dẫn đến sự thay đổi kiểu hình có thể phát hiện. RT-PCR và in situ lai cho phát hiện sự biểu hiện phổ biến của protein kênh dsRNA tương đồng với gen sid-1 ở phôi, ấu trùng và trưởng thành. Kết luận Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng việc áp dụng dsRNA toàn thân tạo ra sự giảm biểu hiện gen cụ thể và lâu dài ở các giai đoạn ấu trùng cào cào vị thành niên. Sự bảo tồn của RNAi toàn thân trong cào cào cho thấy rằng con đường này có thể được khai thác cho việc can thiệp gen cụ thể ở cả giai đoạn vị thành niên và trưởng thành trong một loạt các côn trùng nguyên thủy.

Mặc dù Pseudomonas fluorescens đã được chứng minh là sinh vật gây hư hỏng trong sữa, thịt tươi và sản phẩm thực phẩm bảo quản mát, và tiềm năng đã được công nhận của phage như là chất khử trùng, đến nay không có phage nào được xác định cụ thể cho các loại P. fluorescens từ ngành công nghiệp sữa đã được mô tả gần đây về hiệu quả ly giải của chúng. Chúng tôi mô tả việc tách biệt và đặc trưng một phage ly giải có khả năng nhiễm một loạt các kiểu P. fluorescens được tách biệt từ ngành công nghiệp sữa Bồ Đào Nha và Hoa Kỳ. Nhiều phage đã được tách biệt, cho thấy phổ chủ thể khác nhau và hiệu quả ly giải khác nhau. Một trong số các phage, phage ϕIBB-PF7A, đã được nghiên cứu chi tiết do hiệu quả ly giải của nó đối với nhiều kiểu và ribotype P. fluorescens. Phage ϕIBB-PF7A với đường kính đầu khoảng 63 nm và kích thước đuôi khoảng 13 × 8 nm thuộc về họ Podoviridae và giống một phage kiểu T7 điển hình, như đã được phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Chu kỳ phát triển của phage với thời gian tiềm ẩn phát hiện là 15 phút, thời gian tối thui là 10 phút, kích thước bùng nổ là 153 đơn vị tạo đốm trên mỗi tế bào nhiễm, kích thước genome khoảng 42 kbp, và kích thước cùng trình tự N-terminal của một trong các dải protein, cho thấy sự tương đồng với protein vỏ chính 10A, đều phải đảm bảo với phân loại này. Phage giống T7 được tách biệt, phage ϕIBB-PF7A, nhanh chóng và hiệu quả trong việc ly giải các kiểu P. fluorescens khác nhau và có thể là một ứng viên tốt để được sử dụng như một chất khử trùng nhằm kiểm soát sự xuất hiện của các kiểu P. fluorescens gây hư hỏng trong môi trường thực phẩm và sữa.

Abstract Background The polymerase chain reaction (PCR) is commonly used to detect the presence of nucleic acid sequences both in research and diagnostic settings. While high specificity is often achieved, biological requirements sometimes necessitate that primers are placed in suboptimal locations which lead to problems with the formation of primer dimers and/or misamplification of homologous sequences. Results Pyrococcus abyssi (P.a.) RNase H2 was used to enable PCR to be performed using blocked primers containing a single ribonucleotide residue which are activated via cleavage by the enzyme (rhPCR). Cleavage occurs 5'-to the RNA base following primer hybridization to the target DNA. The requirement of the primer to first hybridize with the target sequence to gain activity eliminates the formation of primer-dimers and greatly reduces misamplification of closely related sequences. Mismatches near the scissile linkage decrease the efficiency of cleavage by RNase H2, further increasing the specificity of the assay. When applied to the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs), rhPCR was found to be far more sensitive than standard allele-specific PCR. In general, the best discrimination occurs when the mismatch is placed at the RNA:DNA base pair. Conclusion rhPCR eliminates the formation of primer dimers and markedly improves the specificity of PCR with respect to off-target amplification. These advantages of the assay should find utility in challenging qPCR applications such as genotyping, high level multiplex assays and rare allele detection.

Abstract Background The development of multiphoton laser scanning microscopy has greatly facilitated the imaging of living tissues. However, the use of genetically encoded fluorescent proteins to distinguish different cell types in living animals has not been described at single cell resolution using multiphoton microscopy. Results Here we describe a method for the simultaneous imaging, by multiphoton microscopy, of Green Fluorescent Protein, Cyan Fluorescent Protein and collagen in vivo in living tumors. This novel method enables: 1) the simultaneous visualization of overall cell shape and sub-cellular structures such as the plasma membrane or proteins of interest in cells inside living animals, 2) direct comparison of the behavior of single cells from different cell lines in the same microenvironment in vivo. Conclusion Using this multi-fluor, multiphoton technique, we demonstrate that motility and metastatic differences between carcinoma cells of differing metastatic potential can be imaged in the same animal simultaneously at sub-cellular resolution.

The interpretability of microarray data can be affected by sample quality. To systematically explore how RNA quality affects microarray assay performance, a set of rat liver RNA samples with a progressive change in RNA integrity was generated by thawing frozen tissue or by ex vivo incubation of fresh tissue over a time course. Incubation of tissue at 37°C for several hours had little effect on RNA integrity, but did induce changes in the transcript levels of stress response genes and immune cell markers. In contrast, thawing of tissue led to a rapid loss of RNA integrity. Probe sets identified as most sensitive to RNA degradation tended to be located more than 1000 nucleotides upstream of their transcription termini, similar to the positioning of control probe sets used to assess sample quality on Affymetrix GeneChip® arrays. Samples with RNA integrity numbers less than or equal to 7 showed a significant increase in false positives relative to undegraded liver RNA and a reduction in the detection of true positives among probe sets most sensitive to sample integrity for in silico modeled changes of 1.5-, 2-, and 4-fold. Although moderate levels of RNA degradation are tolerated by microarrays with 3'-biased probe selection designs, in this study we identify a threshold beyond which decreased specificity and sensitivity can be observed that closely correlates with average target length. These results highlight the value of annotating microarray data with metrics that capture important aspects of sample quality.

Abstract Background Genetically encoded sensors developed on the basis of green fluorescent protein (GFP)-like proteins are becoming more and more popular instruments for monitoring cellular analytes and enzyme activities in living cells and transgenic organisms. In particular, a number of Ca2+ sensors have been developed, either based on FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) changes between two GFP-mutants or on the change in fluorescence intensity of a single circularly permuted fluorescent protein (cpFP). Results Here we report significant progress on the development of the latter type of Ca2+ sensors. Derived from the knowledge of previously reported cpFP-based sensors, we generated a set of cpFP-based indicators with different spectral properties and fluorescent responses to changes in Ca2+ concentration. Two variants, named Case12 and Case16, were characterized by particular high brightness and superior dynamic range, up to 12-fold and 16.5-fold increase in green fluorescence between Ca2+-free and Ca2+-saturated forms. We demonstrated the high potential of these sensors on various examples, including monitoring of Ca2+ response to a prolonged glutamate treatment in cortical neurons. Conclusion We believe that expanded dynamic range, high brightness and relatively high pH-stability should make Case12 and Case16 popular research tools both in scientific studies and high throughput screening assays.