Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods – evaluation of outliers and comparison of calibration curves Tập 5 Số 1 - 2005
Malcolm Burns, Gavin Nixon, Carole A. Foy, Neil Harris
Abstract
Background
As real-time quantitative PCR (RT-QPCR) is increasingly being relied upon for the enforcement of legislation and regulations dependent upon the trace detection of DNA, focus has increased on the quality issues related to the technique. Recent work has focused on the identification of factors that contribute towards significant measurement uncertainty in the real-time quantitative PCR technique, through investigation of the experimental design and operating procedure. However, measurement uncertainty contributions made during the data analysis procedure have not been studied in detail. This paper presents two additional approaches for standardising data analysis through the novel application of statistical methods to RT-QPCR, in order to minimise potential uncertainty in results.
Results
Experimental data was generated in order to develop the two aspects of data handling and analysis that can contribute towards measurement uncertainty in results. This paper describes preliminary aspects in standardising data through the application of statistical techniques to the area of RT-QPCR. The first aspect concerns the statistical identification and subsequent handling of outlying values arising from RT-QPCR, and discusses the implementation of ISO guidelines in relation to acceptance or rejection of outlying values. The second aspect relates to the development of an objective statistical test for the comparison of calibration curves.
Conclusion
The preliminary statistical tests for outlying values and comparisons between calibration curves can be applied using basic functions found in standard spreadsheet software. These two aspects emphasise that the comparability of results arising from RT-QPCR needs further refinement and development at the data-handling phase. The implementation of standardised approaches to data analysis should further help minimise variation due to subjective judgements. The aspects described in this paper will help contribute towards the development of a set of best practice guidelines regarding standardising handling and interpretation of data arising from RT-QPCR experiments.
Nymphal RNAi: systemic RNAi mediated gene knockdown in juvenile grasshopper Tập 5 Số 1 - 2005
Ying Dong, Markus Friedrich
Abstract
Background
Grasshopper serves as important model system in neuroscience, development and evolution. Representatives of this primitive insect group are also highly relevant targets of pest control efforts. Unfortunately, the lack of genetics or gene specific molecular manipulation imposes major limitations to the study of grasshopper biology.
Results
We investigated whether juvenile instars of the grasshopper species Schistocerca americana are conducive to gene silencing via the systemic RNAi pathway. Injection of dsRNA corresponding to the eye colour gene vermilion into first instar nymphs triggered suppression of ommochrome formation in the eye lasting through two instars equivalent to 10–14 days in absolute time. QRT-PCR analysis revealed a two fold decrease of target transcript levels in affected animals. Control injections of EGFP dsRNA did not result in detectable phenotypic changes. RT-PCR and in situ hybridization detected ubiquitous expression of the grasshopper homolog of the dsRNA channel protein gene sid-1 in embryos, nymphs and adults.
Conclusion
Our results demonstrate that systemic dsRNA application elicits specific and long-term gene silencing in juvenile grasshopper instars. The conservation of systemic RNAi in the grasshopper suggests that this pathway can be exploited for gene specific manipulation of juvenile and adult instars in a wide range of primitive insects.
Tách biệt và đặc trưng một phage ly giải giống T7 cho Pseudomonas fluorescens Dịch bởi AI Tập 8 - Trang 1-11 - 2008
Sanna Sillankorva, Peter Neubauer, Joana Azeredo
Mặc dù Pseudomonas fluorescens đã được chứng minh là sinh vật gây hư hỏng trong sữa, thịt tươi và sản phẩm thực phẩm bảo quản mát, và tiềm năng đã được công nhận của phage như là chất khử trùng, đến nay không có phage nào được xác định cụ thể cho các loại P. fluorescens từ ngành công nghiệp sữa đã được mô tả gần đây về hiệu quả ly giải của chúng. Chúng tôi mô tả việc tách biệt và đặc trưng một phage ly giải có khả năng nhiễm một loạt các kiểu P. fluorescens được tách biệt từ ngành công nghiệp sữa Bồ Đào Nha và Hoa Kỳ. Nhiều phage đã được tách biệt, cho thấy phổ chủ thể khác nhau và hiệu quả ly giải khác nhau. Một trong số các phage, phage ϕIBB-PF7A, đã được nghiên cứu chi tiết do hiệu quả ly giải của nó đối với nhiều kiểu và ribotype P. fluorescens. Phage ϕIBB-PF7A với đường kính đầu khoảng 63 nm và kích thước đuôi khoảng 13 × 8 nm thuộc về họ Podoviridae và giống một phage kiểu T7 điển hình, như đã được phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Chu kỳ phát triển của phage với thời gian tiềm ẩn phát hiện là 15 phút, thời gian tối thui là 10 phút, kích thước bùng nổ là 153 đơn vị tạo đốm trên mỗi tế bào nhiễm, kích thước genome khoảng 42 kbp, và kích thước cùng trình tự N-terminal của một trong các dải protein, cho thấy sự tương đồng với protein vỏ chính 10A, đều phải đảm bảo với phân loại này. Phage giống T7 được tách biệt, phage ϕIBB-PF7A, nhanh chóng và hiệu quả trong việc ly giải các kiểu P. fluorescens khác nhau và có thể là một ứng viên tốt để được sử dụng như một chất khử trùng nhằm kiểm soát sự xuất hiện của các kiểu P. fluorescens gây hư hỏng trong môi trường thực phẩm và sữa.
#Pseudomonas fluorescens #phage ly giải #Podoviridae #vi sinh vật gây hư hỏng #môi trường thực phẩm
RNase H-dependent PCR (rhPCR): improved specificity and single nucleotide polymorphism detection using blocked cleavable primers Tập 11 Số 1 - 2011
Joseph R. Dobosy, Scott D. Rose, Kristin R Beltz, Susan M Rupp, Kristy M Powers, Mark A. Behlke, Joseph A. Walder
Abstract
Background
The polymerase chain reaction (PCR) is commonly used to detect the presence of nucleic acid sequences both in research and diagnostic settings. While high specificity is often achieved, biological requirements sometimes necessitate that primers are placed in suboptimal locations which lead to problems with the formation of primer dimers and/or misamplification of homologous sequences.
Results
Pyrococcus abyssi (P.a.) RNase H2 was used to enable PCR to be performed using blocked primers containing a single ribonucleotide residue which are activated via cleavage by the enzyme (rhPCR). Cleavage occurs 5'-to the RNA base following primer hybridization to the target DNA. The requirement of the primer to first hybridize with the target sequence to gain activity eliminates the formation of primer-dimers and greatly reduces misamplification of closely related sequences. Mismatches near the scissile linkage decrease the efficiency of cleavage by RNase H2, further increasing the specificity of the assay. When applied to the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs), rhPCR was found to be far more sensitive than standard allele-specific PCR. In general, the best discrimination occurs when the mismatch is placed at the RNA:DNA base pair.
Conclusion
rhPCR eliminates the formation of primer dimers and markedly improves the specificity of PCR with respect to off-target amplification. These advantages of the assay should find utility in challenging qPCR applications such as genotyping, high level multiplex assays and rare allele detection.
Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivousing multiphoton microscopy - 2005
Erik Sahai, Jeffrey Wyckoff, Ulrike Philippar, Jeffrey E. Segall, Frank B. Gertler, John S. Condeelis
Abstract
Background
The development of multiphoton laser scanning microscopy has greatly facilitated the imaging of living tissues. However, the use of genetically encoded fluorescent proteins to distinguish different cell types in living animals has not been described at single cell resolution using multiphoton microscopy.
Results
Here we describe a method for the simultaneous imaging, by multiphoton microscopy, of Green Fluorescent Protein, Cyan Fluorescent Protein and collagen in vivo in living tumors. This novel method enables: 1) the simultaneous visualization of overall cell shape and sub-cellular structures such as the plasma membrane or proteins of interest in cells inside living animals, 2) direct comparison of the behavior of single cells from different cell lines in the same microenvironment in vivo.
Conclusion
Using this multi-fluor, multiphoton technique, we demonstrate that motility and metastatic differences between carcinoma cells of differing metastatic potential can be imaged in the same animal simultaneously at sub-cellular resolution.
Characterization of the effect of sample quality on high density oligonucleotide microarray data using progressively degraded rat liver RNA Tập 7 - Trang 1-12 - 2007
Karol L Thompson, P Scott Pine, Barry A Rosenzweig, Yaron Turpaz, Jacques Retief
The interpretability of microarray data can be affected by sample quality. To systematically explore how RNA quality affects microarray assay performance, a set of rat liver RNA samples with a progressive change in RNA integrity was generated by thawing frozen tissue or by ex vivo incubation of fresh tissue over a time course. Incubation of tissue at 37°C for several hours had little effect on RNA integrity, but did induce changes in the transcript levels of stress response genes and immune cell markers. In contrast, thawing of tissue led to a rapid loss of RNA integrity. Probe sets identified as most sensitive to RNA degradation tended to be located more than 1000 nucleotides upstream of their transcription termini, similar to the positioning of control probe sets used to assess sample quality on Affymetrix GeneChip® arrays. Samples with RNA integrity numbers less than or equal to 7 showed a significant increase in false positives relative to undegraded liver RNA and a reduction in the detection of true positives among probe sets most sensitive to sample integrity for in silico modeled changes of 1.5-, 2-, and 4-fold. Although moderate levels of RNA degradation are tolerated by microarrays with 3'-biased probe selection designs, in this study we identify a threshold beyond which decreased specificity and sensitivity can be observed that closely correlates with average target length. These results highlight the value of annotating microarray data with metrics that capture important aspects of sample quality.
Single fluorescent protein-based Ca2+sensors with increased dynamic range Tập 7 Số 1 - 2007
Ekaterina A. Souslova, Vsevolod V. Belousov, John G. Lock, Staffan Strömblad, Sergey Kasparov, A D Bolshakov, V. G. Pinelis, Yulii A. Labas, Sergey Lukyanov, Lorenz M. Mayr, Dmitriy M. Chudakov
Abstract
Background
Genetically encoded sensors developed on the basis of green fluorescent protein (GFP)-like proteins are becoming more and more popular instruments for monitoring cellular analytes and enzyme activities in living cells and transgenic organisms. In particular, a number of Ca2+ sensors have been developed, either based on FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) changes between two GFP-mutants or on the change in fluorescence intensity of a single circularly permuted fluorescent protein (cpFP).
Results
Here we report significant progress on the development of the latter type of Ca2+ sensors. Derived from the knowledge of previously reported cpFP-based sensors, we generated a set of cpFP-based indicators with different spectral properties and fluorescent responses to changes in Ca2+ concentration. Two variants, named Case12 and Case16, were characterized by particular high brightness and superior dynamic range, up to 12-fold and 16.5-fold increase in green fluorescence between Ca2+-free and Ca2+-saturated forms. We demonstrated the high potential of these sensors on various examples, including monitoring of Ca2+ response to a prolonged glutamate treatment in cortical neurons.
Conclusion
We believe that expanded dynamic range, high brightness and relatively high pH-stability should make Case12 and Case16 popular research tools both in scientific studies and high throughput screening assays.
Một phương pháp miễn dịch kết tủa đơn giản hóa để đo lường định lượng phản ứng kháng thể trong mẫu huyết thanh lâm sàng bằng cách sử dụng protein fusion kháng nguyên Renillaluciferase được sản xuất từ động vật có vú Dịch bởi AI Tập 5 Số 1 - 2005
Peter D. Burbelo, Radoslav Goldman, Thomas L. Mattson
Tóm tắtĐặt vấn đềCác xét nghiệm phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng nguyên người có lợi ích y tế. Tuy nhiên, tính hữu ích của các định dạng miễn dịch đơn giản hiện có bị giới hạn bởi những cân nhắc về kỹ thuật như sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh đối với các tạp chất trong kháng nguyên chưa đủ tinh khiết, một vấn đề có thể trở nên nghiêm trọng hơn khi các bộ kháng nguyên được sàng lọc để thu thập dữ liệu có ích trong lâm sàng.
Kết quảChúng tôi đã phát triển một công nghệ miễn dịch kết tủa đơn giản và mới để xác định huyết thanh lâm sàng chứa các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên và để tạo ra hồ sơ phản ứng kháng thể định lượng. Phương pháp này dựa trên việc ghép nối các kháng nguyên protein với một enzyme báo cáo, Renillaluciferase (Ruc), và biểu hiện những ghép nối này trong các tế bào động vật có vú, nơi các sửa đổi hậu phiên mã đặc hiệu động vật có vú có thể được thêm vào. Sau khi trộn các chiết xuất thô, huyết thanh và biên A/G lại với nhau và ủ, trong đó các ghép nối Ruc-kháng nguyên sẽ bị giữ lại trên các biên A/G, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên được định lượng bằng cách rửa biên và thêm cơ chất coelenterazine và đo lường sự phát sinh ánh sáng.
Chúng tôi đã đặc trưng công nghệ này với huyết thanh từ những bệnh nhân mắc ba loại ung thư khác nhau. Chúng tôi cho thấy rằng 20-85% số huyết thanh này chứa nồng độ kháng thể đáng kể chống lại ít nhất một trong năm protein liên quan đến u bị đột biến và/hoặc overexpressed. Năm trong số sáu mẫu huyết thanh ung thư đại tràng thử nghiệm cho phản ứng có ý nghĩa thống kê lớn hơn mức trung bình cộng ba độ lệch chuẩn của 10 mẫu huyết thanh đối chứng. Kết quả của các thí nghiệm đối kháng, ủ trước huyết thanh dương tính với các kháng nguyên được sản xuất từ E. coli không bị biến đổi, khác biệt rất nhiều.
Kết luậnCông nghệ này có một số lợi thế so với các xét nghiệm miễn dịch định lượng hiện tại bao gồm tính đơn giản tương đối của nó, sự tránh của các vấn đề liên quan đến các kháng nguyên do E. coli sản xuất và việc sử dụng các kháng nguyên có thể mang theo các sửa đổi hậu phiên mã đặc hiệu động vật có vú hoặc bệnh. Xét nghiệm này nên được sử dụng chung để phân tích huyết thanh cho các kháng thể nhận biết bất kỳ protein nào hoặc các sửa đổi hậu phiên mã của nó.
