Molecular Plant-Microbe Interactions

Can thiệp RNA có giá trị trong việc xác định chức năng gen ở nhiều sinh vật. Giun tròn ký sinh thực vật không thể tiếp nhận RNA thông qua tiêm vi, và không có sự hấp thụ qua đường miệng cho đến khi chúng ở trong cây. Chúng tôi đã sử dụng octopamine để kích thích sự hấp thụ từ những con giun tròn tiền ký sinh giai đoạn hai của hai loại giun tròn kén, Heterodera glycines và Globodera pallida. Kỹ thuật mới này đã được sử dụng để tạo điều kiện cho sự hấp thụ RNA hai sợi (dsRNA) cùng với isothiocyanate fluorescein như một dấu hiệu trực quan. Việc nhắm mục tiêu vào các proteinase cysteine không làm giảm số lượng ký sinh trùng, nhưng đã gây ra sự thay đổi từ tỷ lệ giới tính nữ/nam bình thường là 3:1 sang 1:1 sau 14 ngày bị nhiễm (dpi). Việc tiếp xúc H. glycines với dsRNA tương ứng với một protein mới được đặc trưng có tính đồng đoạn với lectin loại C không ảnh hưởng đến số phận giới tính, nhưng đã thu hồi ít hơn 41% ký sinh trùng từ cây trồng. Như mong đợi, việc điều trị bằng dsRNA tương ứng với protein tinh trùng chính (MSP) không có ảnh hưởng đến sự phát triển của ký sinh trùng hay số phận giới tính trong 14 ngày. Phân tích Northern cho thấy có sự giảm sự dồi dào của bản sao cho hai mRNA nhắm mục tiêu xuất hiện trong J2, cùng với một sự ức chế muộn hơn đối với bản sao MSP khi con đực phát triển tinh trùng ở 15 dpi. Những phát hiện này thiết lập một quy trình cho RNAi của giun tròn ký sinh thực vật.

Chúng tôi đã sử dụng nhiều loại tác nhân cho nitric oxide (NO) để chứng minh rằng NO ức chế các hoạt động của catalase thuốc lá và ascorbate peroxidase (APX). Sự ức chế này dường như là có thể đảo ngược vì việc loại bỏ tác nhân NO dẫn đến sự phục hồi đáng kể của hoạt động enzym. Ngược lại, APX và catalase bị ức chế không thể đảo ngược bởi peroxynitrite. Khả năng của NO và peroxynitrite trong việc ức chế hai enzym chính trong việc thu hồi H₂O₂ trong các tế bào thực vật cho thấy rằng NO có thể tham gia vào tín hiệu redox trong quá trình kích hoạt các phản ứng phòng thủ sau khi bị tấn công bởi mầm bệnh.

Các gen kháng phấn hôi gạo (R) Pi2 và Piz-t mang lại khả năng kháng rộng rãi đối với các bộ tách khác nhau của các isolát Magnaporthe grisea. Chúng tôi đã xác định gen Pi2 đầu tiên bằng chiến lược nhân bản dựa trên bản đồ gen. Gen Pi2 là thành viên của một cụm gen bao gồm chín thành viên (được đặt tên là Nbs1-Pi2 đến Nbs9-Pi2) và mã hóa một protein có vị trí liên kết nucleotide và miền lặp lại giàu leucine (LRR). Việc lập bản đồ gen tinh vi, đặc trưng phân tử của các đột biến nhạy cảm với Pi2, và các thử nghiệm bổ sung chỉ ra rằng Nbs4-Pi2 là gen Pi2. Gen Piz-t, một alen của Pi2 trong giống lúa Toride 1, được tách biệt dựa trên thông tin trình tự của Pi2. Các thử nghiệm bổ sung xác nhận rằng thành viên trong gia đình Nbs4-Piz-t là Piz-t. So sánh trình tự cho thấy chỉ có tám thay đổi amino acid, mà chỉ nằm trong ba LRR liên tiếp, phân biệt Piz-t với Pi2. Trong số tám biến thể này, chỉ có một biến thể nằm trong motif xxLxLxx. Việc trao đổi tương hỗ một amino acid đơn giữa Pi2 và Piz-t không chuyển đổi tính đặc hiệu kháng của nhau mà ngược lại, đã làm mất chức năng của cả hai protein kháng. Những kết quả này cho thấy rằng một amino acid đơn trong motif xxLxLxx có thể là rất quan trọng để duy trì bề mặt nhận diện của Pi2 và Piz-t đối với các protein avirulence tương ứng của chúng.

NPR1/NIM1 của Arabidopsis là một yếu tố điều tiết chính trong khả năng kháng bệnh thu được theo hệ thống (SAR), mang lại khả năng kháng bền vững rộng rãi. Các báo cáo trước đây cho thấy lúa có một con đường kháng bệnh tương tự như con đường SAR của Arabidopsis. Ở đây, chúng tôi báo cáo việc phân lập và đặc tính hóa một đồng hình NPR1 ở lúa (NH1). Các cây lúa chuyển gen biểu hiện quá mức NH1 (NH1ox) đạt được mức độ kháng cao đối với Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Biểu hiện kháng này có thể di truyền và tương quan với sự hiện diện của gen chuyển và sự giảm tăng trưởng của vi khuẩn. Phân tích Northern cho thấy rằng cây lúa NH1ox tự phát kích hoạt các gen phòng thủ, trái ngược với ngô Arabidopsis biểu hiện quá mức NPR1, nơi mà các gen phòng thủ không được kích hoạt cho đến khi có sự khởi động. NH1 kiểu hoang dã, nhưng không phải là một đột biến điểm tương ứng với npr1-1, tương tác mạnh mẽ với yếu tố phiên mã rTGA2.2 của lúa trong thí nghiệm lai hai thủy tinh. Các cây NH1ox trồng trong nhà kính phát triển các đốm giống như tổn thương trên lá ở giai đoạn trước ra hoa mặc dù không quan sát thấy các hiệu ứng phát triển khác. Tuy nhiên, khi được trồng trong các buồng tăng trưởng (GCs) dưới ánh sáng yếu, các cây NH1ox bị lùn lại, cho thấy có độ nhạy cảm cao hơn với ánh sáng. Các cây NH1ox trồng trong GC cho thấy mức axit salicylic (SA) cao hơn nhiều so với kiểu hoang dã, trong khi các cây NH1ox trồng trong nhà kính chứa ít SA hơn. Những kết quả này chỉ ra rằng NH1 có thể tham gia vào việc điều tiết SA phản ứng với thay đổi môi trường.

Bài báo này là một phần trong loạt bài đánh giá nổi bật về những đột phá khái niệm và phương pháp trong tương tác giữa thực vật và vi sinh vật.

Axit Salicylic (SA) là một hormone thực vật quan trọng điều chỉnh nhiều khía cạnh của sự phát triển và sinh trưởng của thực vật cũng như việc kích hoạt các cơ chế phòng vệ chống lại căng thẳng sinh học và phi sinh học. Ở đây, chúng tôi trình bày một cái nhìn tổng quan lịch sử về tiến trình mà chúng tôi đã đạt được đến nay trong việc làm sáng tỏ vai trò của SA trong việc thông hiệu ứng miễn dịch của thực vật. Khả năng của thực vật có thể phát triển miễn dịch thu được sau khi bị nhiễm bệnh được đề xuất lần đầu tiên vào năm 1933. Tuy nhiên, hầu hết những kiến thức của chúng ta về thông hiệu miễn dịch thực vật được hình thành trong ba thập kỷ qua, sau khi phát hiện ra rằng SA là một tín hiệu phòng vệ nội sinh. Trong khoảng thời gian này, các nhà nghiên cứu đã xác định i) hai con đường mà qua đó SA có thể được tổng hợp, ii) nhiều protein điều chỉnh sự tổng hợp và chuyển hóa của SA, và iii) một số thành phần thông hiệu hoạt động dưới tác động của SA, bao gồm một số lượng lớn các đích hoặc thụ thể của SA. Ngoài ra, ngày càng rõ ràng rằng SA không thông hiệu kích ứng miễn dịch một mình mà, thay vào đó, là một phần của một mạng lưới phức tạp có liên quan đến nhiều hormone thực vật khác. Do đó, những nỗ lực trong tương lai để phát triển một hiểu biết toàn diện về thông hiệu miễn dịch do SA môi giới sẽ cần phải lấp đầy những khoảng trống kiến thức tồn tại trong chính con đường SA cũng như làm rõ cách thức giao tiếp chéo giữa các con đường thông hiệu hormone khác nhau dẫn đến một phản ứng miễn dịch vừa mạnh mẽ vừa được tối ưu hóa cho hiệu quả tối đa, tùy thuộc vào bản sắc của tác nhân gây bệnh tấn công.

Mặc dù đã xác định được 109 gen WRKY trong bộ gen lúa, chức năng của hầu hết chúng vẫn chưa được biết đến. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ ra rằng OsWRKY13 đóng vai trò quan trọng trong khả năng chống bệnh của lúa. Việc overexpression OsWRKY13 có thể tăng cường khả năng kháng bệnh của lúa đối với bệnh cháy bacterial và bệnh nấm blast, hai trong số những bệnh tồi tệ nhất đối với lúa trên toàn cầu, ở cả giai đoạn cây giống và cây trưởng thành, và không ảnh hưởng đến độ phì nhiêu. Việc overexpression này đi kèm với sự kích hoạt của các gen liên quan đến tổng hợp axit salicylic (SA) và các gen phản ứng với SA cũng như sự подавление của các gen liên quan đến tổng hợp axit jasmonic (JA) và các gen phản ứng với JA. OsWRKY13 đã liên kết với các promoter của chính nó và ít nhất ba gen khác trong các đường tín hiệu phụ thuộc vào SA và JA. Hoạt động liên kết DNA của nó bị ảnh hưởng bởi sự nhiễm khuẩn. Các kết quả này gợi ý rằng OsWRKY13, với tư cách là một chất kích hoạt của đường dẫn phụ thuộc vào SA và chất ức chế các đường dẫn phụ thuộc vào JA, làm trung gian cho khả năng chống bệnh của lúa bằng cách điều chỉnh trực tiếp hoặc gián tiếp việc biểu hiện của một tập hợp các gen hoạt động ở cả phía thượng và hạ nguồn của SA và JA. Hơn nữa, OsWRKY13 sẽ cung cấp một công cụ biến đổi gen để kỹ thuật lúa có khả năng kháng rộng hơn và ở tất cả các giai đoạn phát triển trong các chương trình nhân giống.

Nhiều vi khuẩn Gram âm điều chỉnh sự biểu hiện của các tập hợp gen chuyên biệt khi đáp ứng với mật độ quần thể. Cơ chế điều chỉnh này, được gọi là tự định hình (autoinduction) hoặc cảm nhận mật độ quần thể (quorum sensing), dựa trên việc sản xuất bởi vi khuẩn một phân tử tín hiệu nhỏ, dễ khuếch tán gọi là autoinducer. Trong các hệ thống được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất, các autoinducer là các dẫn xuất N-acyl hóa của l-homoserine lactone (acyl-HSL). Đặc tính tín hiệu được quy định bởi độ dài và bản chất của sự thay thế tại C-3 của chuỗi bên acyl. Chúng tôi đã đánh giá bốn báo cáo sinh học acyl-HSL, dựa trên tra của Agrobacterium tumefaciens, lux của Vibrio fischeri, las của Pseudomonas aeruginosa, và sản xuất sắc tố của Chromobacterium violaceum, về khả năng phát hiện các tập hợp 3-oxo acyl-HSLs, 3-hydroxy acyl-HSLs, và alkanoyl-HSLs với độ dài chuỗi từ C₄ đến C₁₂. Báo cáo fusion traG::lacZ từ plasmid Ti của A. tumefaciens là thiết bị cảm biến nhạy cảm và linh hoạt nhất trong bốn loại. Sử dụng thiết bị báo cáo này, chúng tôi đã sàng lọc 106 chủng đại diện cho bảy giống vi khuẩn liên kết với thực vật. Phần lớn các chủng Agrobacterium, Rhizobium, và Pantoea cùng khoảng một nửa các chủng Erwinia và Pseudomonas đã cho phản ứng dương tính. Chỉ một vài chủng Xanthomonas tạo ra tín hiệu có thể phát hiện. Chúng tôi đã xác định các acyl-HSLs được sản xuất bởi một phần nhỏ các chủng thông qua sắc ký lớp mỏng. Trong số các pseudomonads và erwinias, phần lớn sản xuất một hoạt động chiếm ưu thế duy nhất phản ánh tính chất của N-(3-oxo-hexanoyl)-l-HSL. Tuy nhiên, một số ít erwinias, cùng với các chủng P. fluorescens và Ralstonia solanacearum, đã sản xuất tín hiệu hoàn toàn khác biệt, bao gồm các dạng 3-hydroxy, cũng như các hợp chất hoạt động đã sắc ký với các tính chất không giống bất cứ tiêu chuẩn nào của chúng tôi. Một vài xanthomonads dương tính, và gần như tất cả các vi khuẩn Agrobacterium, sản xuất một lượng nhỏ hợp chất với các tính chất sắc ký của N-(3-oxo-octanoyl)-l-HSL. Các chi Rhizobium cho thấy sự đa dạng lớn nhất, với một số sản xuất chỉ một tín hiệu và số khác sản xuất đến bảy tín hiệu có thể phát hiện. Một số chủng sản xuất các hợp chất cực kỳ không phân cực cho thấy chuỗi bên acyl rất dài. Việc sản xuất các hợp chất này gợi ý rằng cảm nhận mật độ quần thể là điều phổ biến như một cơ chế điều chỉnh gen giữa các vi khuẩn liên kết với thực vật thuộc nhóm Gram âm.

Các nghiên cứu phân tử gần đây về sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh đã tiết lộ sự phong phú lớn về các loài. Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy tăng trưởng và năng suất thực vật, ức chế mầm bệnh, có thể giúp loại bỏ chất ô nhiễm, hòa tan photphat, hoặc cung cấp nitơ có thể hấp thụ cho thực vật. Một số vi khuẩn nội sinh được mang từ hạt giống, nhưng một số khác có cơ chế để định cư trong các loại thực vật đang được nghiên cứu. Các đột biến vi khuẩn không có khả năng sản xuất protein tiết ra bị hạn chế trong quá trình định cư. Các gen thực vật được biểu hiện trong sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh cung cấp manh mối về ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh đối với thực vật. Phân tích phân tử cho thấy rằng các phản ứng phòng thủ của thực vật giới hạn quần thể vi khuẩn bên trong thực vật. Một số mầm bệnh của người, như Salmonella spp., đã được phát hiện là vi khuẩn nội sinh, và những vi khuẩn này không bị loại bỏ bởi các quy trình khử trùng loại bỏ vi khuẩn bề mặt. Việc đưa vi khuẩn nội sinh vào môi trường hoặc các cánh đồng nông nghiệp cần được đánh giá cẩn thận để tránh việc giới thiệu mầm bệnh.

Despite the fact that a large number of miRNA sequences have been determined in diverse plant species, reports demonstrating the functional roles of miRNAs in the plant response to pathogens are severely limited. Here, Arabidopsis thaliana miRNA844 (miR844) was investigated for its functional role in the defense response to diverse pathogens. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing miR844 (35S::miR844) displayed much more severe disease symptoms than the wild-type plants when challenged with the bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 or the fungus Botrytis cinerea. By contrast, a loss-of-function mir844 mutant showed an enhanced resistance against the pathogens. Although no cleavage was observed at the predicted cleavage site of the putative target mRNA, cytidinephosphate diacylglycerol synthase3 (CDS3), cleavage was observed at 6, 12, 21, or 52 bases upstream of the predicted cleavage site of CDS3 mRNA, and the level of CDS3 mRNA was downregulated by the overexpression of miR844, implying that miR844 influences CDS3 transcript level. To further confirm that the miR844-mediated defense response was due to the decrease in CDS3 mRNA level, the disease response of a CDS3 loss-of-function mutant was analyzed upon pathogen challenge. Increased susceptibility of both cds3 mutant and 35S::miR844 plants to pathogens confirmed that miR844 affected the defense response by downregulating CDS3 mRNA. The expression of miR844 was decreased, and the CDS3 transcript level increased upon pathogen challenge. Taken together, these results provide evidence that downregulation of miR844 and a concomitant increase in CDS3 expression is a defensive response of Arabidopsis to bacteria and fungi.

The Hrp pilus, composed of HrpA subunits, is an essential component of the type III secretion system in Pseudomonas syringae. We used electron microscopy (EM) and immunocytochemistry to examine production of the pilus in vitro from P. syringae pv. tomato strain DC3000 grown under hrp-inducing conditions on EM grids. Pili, when labeled with antibodies to HrpA, developed rapidly in a nonpolar manner shortly after the detection of the hrpA transcript and extended up to 5 μm into surrounding media. Structures at the base of the pilus were clearly differentiated from the basal bodies of flagella. The HrpZ protein, also secreted via the type III system, was found by immunogold labeling to be associated with the pilus in vitro. Accumulation and secretion of HrpA and HrpZ were also examined quantitatively after the inoculation of wild-type DC3000 and hrpA and hrpZ mutants into leaves of Arabidopsis thaliana. The functional pilus crossed the plant cell wall to generate tracks of immunogold labeling for HrpA and HrpZ. Mutants that produced HrpA but did not assemble pili were nonpathogenic, did not secrete HrpA protein, and were compromised for the accumulation of HrpZ. A model is proposed in which the rapidly elongating Hrp pilus acts as a moving conveyor, facilitating transfer of effector proteins from bacteria to the plant cytoplasm across the formidable barrier of the plant cell wall.