Kinetoplastid Biology and Disease

Members of the Trypanosomatidae family comprises species that are causative of important human diseases such as Chagas'disease, Leishmaniasis and sleeping sickness. A wealth of evidence has accumulated that illustrates the ability of these unicellular organisms to undergo, with or without induction (stress conditions), a cell death with some features resembling apoptosis-like phenomenon. However, despite the apparent phenotypic similarities between the apoptosis-like death of kinetoplastids and mammalian nucleated cell programmed cell death (PCD), the pathways seem to differ significantly. This review analyses some of the current data related to the cell death in trypanosomatids. Special attention is given to members of conserved protein families demonstrating remarkable diversity and plasticity of function [i.e. elongation factor-1 subunits α and γ ; and the Silent Information Regulator (SIR2)-related gene, showed to be associated with resistance to apoptosis-like death in Leishmania]. The elucidation of the molecular events which tightly regulated the processes of growth arrest, differentiation and death of Trypanosoma cruzi, Leishmania spp and African trypanosomes, might allow not only to define a more comprehensive view of the cell death machinery in term of evolutionary origin but may also be useful to identify new target molecules for chemotherapeutic drug development and therapeutic intervention.

Kinetoplastida are protozoan organisms that probably diverged early in evolution from other eukaryotes. They are characterized by a number of unique features with respect to their energy and carbohydrate metabolism. These organisms possess peculiar peroxisomes, called glycosomes, which play a central role in this metabolism; the organelles harbour enzymes of several catabolic and anabolic routes, including major parts of the glycolytic and pentosephosphate pathways. The kinetoplastid mitochondrion is also unusual with regard to both its structural and functional properties. In this review, we describe the unique compartmentation of metabolism in Kinetoplastida and the metabolic properties resulting from this compartmentation. We discuss the evidence for our recently proposed hypothesis that a common ancestor of Kinetoplastida and Euglenida acquired a photosynthetic alga as an endosymbiont, contrary to the earlier notion that this event occurred at a later stage of evolution, in the Euglenida lineage alone. The endosymbiont was subsequently lost from the kinetoplastid lineage but, during that process, some of its pathways of energy and carbohydrate metabolism were sequestered in the kinetoplastid peroxisomes, which consequently became glycosomes. The evolution of the kinetoplastid glycosomes and the possible selective advantages of these organelles for Kinetoplastida are discussed. We propose that the possession of glycosomes provided metabolic flexibility that has been important for the organisms to adapt easily to changing environmental conditions. It is likely that metabolic flexibility has been an important selective advantage for many kinetoplastid species during their evolution into the highly successful parasites today found in many divergent taxonomic groups. Also addressed is the evolution of the kinetoplastid mitochondrion, from a supposedly pluripotent organelle, attributed to a single endosymbiotic event that resulted in all mitochondria and hydrogenosomes of extant eukaryotes. Furthermore, indications are presented that Kinetoplastida may have acquired other enzymes of energy and carbohydrate metabolism by various lateral gene transfer events different from those that involved the algal- and α-proteobacterial-like endosymbionts responsible for the respective formation of the glycosomes and mitochondria.

Current chemotherapy of human African trypanosomiasis or sleeping sickness relies on drugs developed decades ago, some of which show toxic side effects. One promising line of research towards the development of novel anti-trypanosomal drugs are small-molecule inhibitors of Trypanosoma brucei cysteine proteinases. In this study, we demonstrate that treatment of T. brucei-infected mice with the inhibitor, carbobenzoxy-phenylalanyl-alanine-diazomethyl ketone (Z-Phe-Ala-CHN2), alters parasite morphology and inhibits cell division. Following daily intra-peritoneal administration of 250 mg kg-1 of Z-Phe-Ala-CHN2 on days three and four post infection (p.i.), stumpy-like forms with enlarged lysosomes were evident by day five p.i. In addition, trypanosomes exposed to the inhibitor had a 65% greater protein content than those from control mice. Also, in contrast to the normal 16% of parasites containing two kinetoplasts – a hallmark of active mitosis, only 4% of trypanosomes exposed to the inhibitor were actively dividing, indicating cell cycle-arrest. We suggest that inhibition of endogenous cysteine proteinases by Z-Phe-Ala-CHN2 depletes the parasite of essential nutrients necessary for DNA synthesis, which in turn, prevents progression of the cell cycle. This arrest then triggers differentiation of the long-slender into short-stumpy forms.

It is shown using mouse models that the African trypanosomes exert a significant drain upon their host's carbohydrate (energy) resources; and that the higher the parasitemia, the greater the energy demand. It is, therefore, hypothesized that the long slender (LS) to short stumpy (SS) transition evolved, in part, to help control the parasitemia and to increase host survival time. It is also suggested that the SS population is heterogeneous. One part of the population is tsetse infective, while a second older SS population is undergoing apoptotic-like events, which leads to their cell death and their stimulation of the host's immune response. This immune stimulation by the old dying SS forms would eliminate the major LS and SS variant antigen population, and produce the chronic relapsing infection. It is concluded that the SS stages during the apoptosis-like process are acting altruistically. They give their lives to insure the long-term survival of the host, and to insure renewed growth of the minor LS variants and new infective SS forms. This process is predicted to increase the probability for the successful transmission of the trypanosomes to a new host.

Trypanosoma rangeli là một loài động vật nguyên sinh gây bệnh quan trọng đối với nhiều loài động vật có vú ở các vùng Trung và Nam Mỹ, chia sẻ khu vực địa lý, véc tơ và bể chứa với T. cruzi, tác nhân gây bệnh Chagas. Do đó, sự xuất hiện của các nhiễm trùng đơn lẻ và/hoặc hỗn hợp, bao gồm ở người, phải được dự kiến và có tầm quan trọng lớn cho chẩn đoán chuyên biệt và dịch tễ học. So với nhiều loài thuộc họ Trypanosomatidae, sinh học và bộ gen của T. rangeli còn ít được biết đến, tăng cường nhu cầu về một sáng kiến phát hiện gen. Sáng kiến transcriptome của T. rangeli nhằm thúc đẩy việc phát hiện gen thông qua việc tạo ra các thẻ chuỗi biểu hiện (ESTs) và các Orestes (ORF ESTs) từ cả hai dạng ký sinh trùng là epimastigote và trypomastigote, cho phép các nghiên cứu sâu hơn về sinh học, phân loại và phát sinh loài của ký sinh trùng.

Một xét nghiệm dựa trên phản ứng chuỗi polymerase nested (nPCR) đã được phát triển và đánh giá để phát hiện nhanh chóng Trypanosoma evansi ở chuột thí nghiệm và lạc đà một bướu (Camelus dromedarius) tự nhiên bị nhiễm bệnh. Bốn mồi oligonucleotide (TE1, TE2, TE3 và TE4) được chọn từ gen lặp đi lặp lại trong nhân của T. evansi, đã được thiết kế và sử dụng cho quá trình khuếch đại PCR. Quá trình khuếch đại đầu tiên, sử dụng một cặp mồi ngoài TE1 và TE2, đã sản xuất một sản phẩm PCR chính có độ dài 821 bp từ DNA của T. evansi. Quá trình khuếch đại thứ hai, sử dụng cặp mồi nested (nội) TE3 và TE4, đã sản xuất một sản phẩm PCR có độ dài 270 bp. DNA của T. evansi được trích xuất từ mẫu máu của chuột thí nghiệm và lạc đà dromedary Sudan bị nhiễm tự nhiên đã được phát hiện bằng xét nghiệm nPCR này. Các mồi nested TE3 và TE4 đã tăng cường độ nhạy của xét nghiệm PCR, và chỉ với 10 fg DNA của T. evansi (tương đương với một bản sao đơn của gen tiềm năng của ký sinh trùng) đã được khuếch đại và quan sát trên gel agarose nhuộm ethidium bromide. Các sản phẩm khuếch đại không được phát hiện khi áp dụng xét nghiệm PCR đối với DNA từ các ký sinh trùng máu khác bao gồm Thieleria annulata, Babesia bigemina hoặc mẫu không chứa axit nucleic. Việc áp dụng xét nghiệm nPCR này vào các mẫu lâm sàng đã dẫn đến việc phát hiện trực tiếp T. evansi từ nhiều mẫu mô được thu thập từ chuột thí nghiệm bị nhiễm bệnh và máu từ lạc đà bị nhiễm tự nhiên. Xét nghiệm nPCR được mô tả cung cấp một công cụ quý giá để nghiên cứu dịch tễ học của sự nhiễm T. evansi ở lạc đà và các quần thể động vật nhạy cảm khác.

Leishmania spp. trong quá trình sống ký sinh của chúng, tiếp xúc với hai môi trường hoàn toàn khác nhau: ruột của muỗi cát và các phagosome của đại thực bào có vú. Trong quá trình truyền vào động vật có vú, các ký sinh trùng phải đối mặt với nhiệt độ môi trường cao hơn cũng như các nguồn carbon khác nhau. Các protein chaperone phân tử hay các protein sốc nhiệt có liên quan đến những thích ứng cần thiết, bao gồm sự phân hóa có trật tự từ giai đoạn promastigote ngoại bào với旗Moving đến giai đoạn amastigote nội bào. Tại đây, chúng tôi cho thấy rằng CPN10, đồng chaperonin của Leishmania donovani, được tổng hợp với nồng độ tăng đáng kể trong quá trình chuyển đổi in vitro sang giai đoạn amastigote. Chúng tôi đã chứng minh bằng kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử miễn dịch vàng rằng, giống như đối tác phức hợp có thể có của nó là CPN60.2, CPN10 được định vị tại ty thể hình ống đơn của các ký sinh trùng, hơn nữa, nó cũng kết tủa chung với CPN60.2, chaperonin ty thể chủ yếu của Leishmania spp.. Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng nhu cầu về CPN10 tăng lên trong bối cảnh gập protein ty thể trong giai đoạn này của mầm bệnh ở động vật có vú. Hơn nữa, chúng xác nhận CPN60.2 là đồng homologue GroEL thực sự của ty thể trong L. donovani và tương tác được giả thiết của các chaperonin nhân chuẩn, CPN60 và CPN10.

Trong nấm men và Caenorhabditis elegans, các protein Điều chỉnh Thông tin Im lặng (SIR2) đã được chứng minh là tham gia vào quá trình điều hòa lão hóa. Ở Leishmania, LmSIR2rp ban đầu được phân lập từ chất bài tiết/tiết ra của ký sinh trùng Leishmania. Trong số các chức năng của protein này trong sinh học Leishmania, chúng tôi đã ghi nhận sự tham gia của nó trong sự sống sót của ký sinh trùng, đặc biệt là trong các amastigote của Leishmania. Trong bài viết này, chúng tôi đặt câu hỏi về vai trò của dạng bài tiết/tiết ra của protein. Cụ thể, chúng tôi tự hỏi liệu đồng gen Sir2 của Leishmania có tham gia vào một khía cạnh nào đó trong các chức năng sinh học của nó, trong các thành phần và con đường khác nhau, điều này có thể thúc đẩy sự sống sót của tế bào chủ hay không. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã bắt chước sự giải phóng nội bào của protein thông qua sự biểu hiện liên tục trong các tế bào L929 fibrosarcoma của chuột. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng protein LmSIR2 được biểu hiện đúng cách bởi các nguyên bào sợi và rằng LmSIR2 được phân bố cả trong chất tế bào và nhân của tất cả các dòng tế bào đã chuyển gen. Bất ngờ thay, chúng tôi phát hiện rằng các tế bào biểu hiện LmSIR2 có mật độ tế bào bão hòa giảm từ 40% đến 60% và biểu hiện hoạt tính β-galactosidase có tính axit (pH 6.0), điều này được biết đến như một dấu hiệu sinh lý lão hóa. Do đó, chúng tôi quan sát thấy rằng các nguyên bào sợi dương tính với LmSIR2 dễ bị nhiễm Leishmania hơn. LmSIR2 có khả năng can thiệp đáng kể vào sinh lý của tế bào chủ. Vì vậy, thật hấp dẫn khi suy đoán rằng những thay đổi này có thể giúp Leishmania sống sót trong một thời gian dài trong một tế bào với khả năng giảm để nhân lên hoặc phản ứng với các kích thích miễn dịch. Những ý nghĩa tiềm năng của phát hiện của chúng tôi trong quá trình nhiễm in vivo được thảo luận.

Dựa trên gen mã hóa cho Trypanosoma evansi (T. evansi) Glycoprotein Bề Mặt Biến Đổi RoTat 1.2 (VSG) mới được giải mã, một cặp mồi đã được thiết kế nhằm mục tiêu vào vùng DNA không có đặc điểm tương đồng với các gen VSG đã biết khác. Tổng cộng 39 giống trypanosome khác nhau đã được thử nghiệm bằng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa trên RoTat 1.2. PCR này đã tạo ra một sản phẩm dài 205 bp trong tất cả các dòng T. evansi và trong bảy trên chín dòng T. equiperdum được thử nghiệm. Sản phẩm này không được phát hiện trong DNA từ các ký sinh trùng T. b. brucei, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. congolense, T. vivax và T. theileri. PCR Rotat 1.2 có thể phát hiện được chỉ với 10 trypanosome cho mỗi phản ứng với DNA tinh chế từ mẫu máu, tức là 50 trypanosome/ml. Việc khuếch đại PCR của gen VSG RoTat 1.2 là một dấu hiệu đặc hiệu cho các giống T. evansi, ngoại trừ giống T. evansi loại B, và đặc biệt hữu ích cho các giống có tính kém di động, nơi mà các dấu hiệu dựa trên kDNA có thể không khuếch đại được. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi hỗ trợ những gợi ý trước đó rằng một số giống T. evansi đã bị phân loại nhầm là T. equiperdum.

Bệnh leishmaniasis da sau kala azar (PKDL) là một căn bệnh xuất hiện sau khi điều trị bệnh leishmaniasis nội tạng (VL). Tỷ lệ mắc PKDL cao nhất trên thế giới là ở Sudan. Nhiều bệnh nhân tự khỏi trong vòng 6 tháng nhưng những người không hồi phục thì rất khó điều trị, thường phải mất nhiều tháng để tiêm hàng ngày. Những bệnh nhân này mang ký sinh trùng trong da và được cho là nguồn lây nhiễm và có thể dẫn đến dịch bệnh. Các phương pháp điều trị hiện tại cho PKDL không đủ và không thực tế do chi phí cao, thời gian điều trị dài và tác dụng phụ. Cần có một cách tiếp cận mới cho việc điều trị PKDL. Một cuộc họp chung của Chương trình Đặc biệt của UNICEF/UNDP/Ngân hàng Thế giới/WHO về nghiên cứu và đào tạo trong các bệnh nhiệt đới (TDR) và Viện Nghiên cứu Bệnh Truyền nhiễm (IDRI) Seattle, Hoa Kỳ đã được tổ chức để xem xét tiến trình phát triển vắc xin điều trị và lập kế hoạch phát triển các phương pháp điều trị cho PKDL. Lịch sử phát triển vắc xin leishmaniasis cho dự phòng và điều trị đã được xem xét. Ngoại trừ nhiễm trùng trước đó - được mô phỏng bằng cách tiêm ký sinh trùng Leishmania sống như một vắc xin (leishmanization), không có sản phẩm nào của ký sinh trùng chết, với hoặc không có tác nhân hỗ trợ, cho thấy hiệu quả dự phòng đáng kể. Ký sinh trùng chết L. major được hấp phụ bằng nhôm và pha trộn với BCG vẫn cần được thử nghiệm như một vắc xin dự phòng. Các chế phẩm ký sinh trùng chết theo nghĩa là L. mexicana phối hợp với BCG và L. amazonensis (kết hợp với liều thấp antimonial) đã cho thấy hiệu quả trong điều trị miễn dịch và hóa trị miễn dịch, tương ứng. Ngoài ra, hỗn hợp đầy đủ antimonial cộng với vắc xin L. major hấp phụ bằng nhôm đã cho thấy cải thiện đáng kể trong điều trị bệnh nhân PKDL kháng trị. Đây đều là các chế phẩm thô của ký sinh trùng và rất khó định nghĩa và tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên, hiện có một loại vắc xin mới, thế hệ thứ hai, Leish-111f + MPL-SE, bao gồm một protein tái tổ hợp cấu thành từ ba kháng nguyên leishmanial và một tác nhân hỗ trợ được xác định đang trong giai đoạn phát triển lâm sàng. Hóa trị miễn dịch có tiềm năng trở thành một phương pháp điều trị thực tế và phải chăng cho PKDL và các dạng leishmaniasis khác. Kết quả khả quan với vắc xin L. major hấp phụ bằng nhôm + antimonial nên được phát triển. Tuy nhiên, trước các thử nghiệm tiếp theo, cần phải đảm bảo vắc xin có sẵn và sản xuất dưới điều kiện Sản xuất Thực phẩm Tốt, do đó, cần phải đảm bảo kiểm soát chất lượng. Sau khi đảm bảo hồ sơ an toàn thỏa đáng của Leish-111f+MPL-SE, các thử nghiệm lâm sàng sử dụng loại vắc xin này ban đầu với antimonial nên được khởi động. Tương tự, cần xem xét điều trị miễn dịch cho VL với mục tiêu kiểm soát sự phát triển của PKDL. Một số nghiên cứu miễn dịch học cần được thực hiện trước khi khởi đầu liệu pháp miễn dịch cho bệnh nhân VL.