Journal of Molecular Endocrinology

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là phương pháp nhạy nhất để phát hiện mRNA với số lượng thấp, thường thu được từ các mẫu mô hạn chế. Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật phức tạp, có nhiều vấn đề đáng kể liên quan đến độ nhạy, tính tái sản xuất và tính đặc hiệu của nó, và với tư cách là một phương pháp định lượng, nó gặp phải những vấn đề vốn có trong PCR. Sự ra đời gần đây của các quy trình RT-PCR động học dựa trên huỳnh quang đã đơn giản hóa đáng kể quá trình tạo ra sự định lượng mRNA tái sản xuất và hứa hẹn sẽ khắc phục những hạn chế này. Tuy nhiên, việc áp dụng thành công của chúng phụ thuộc vào sự hiểu biết rõ ràng về các vấn đề thực tiễn, và thiết kế thí nghiệm, ứng dụng và xác thực cẩn thận vẫn là điều cần thiết để đo lường định lượng chính xác sự phiên mã. Bài đánh giá này thảo luận về các khía cạnh kỹ thuật liên quan, tương phản giữa các phương pháp RT-PCR thông thường và động học trong việc định lượng biểu hiện gen và so sánh các hệ thống RT-PCR động học khác nhau. Nó minh họa sự hữu ích của những xét nghiệm này bằng cách chứng minh sự khác biệt đáng kể về mức độ phiên mã giữa các cá thể trong họ gen housekeeping, dehydrogenase glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH).

Phương pháp PCR Ngược Dòng Thời gian Thực dựa trên huỳnh quang (RT-PCR) được sử dụng rộng rãi để định lượng mức mRNA ở trạng thái ổn định và là một công cụ quan trọng cho nghiên cứu cơ bản, y học phân tử và công nghệ sinh học. Các thử nghiệm dễ tiến hành, có khả năng xử lý khối lượng lớn, và có thể kết hợp độ nhạy cao với độ đặc hiệu đáng tin cậy. Công nghệ này đang tiến hóa nhanh chóng với sự xuất hiện của các enzym, hóa chất và thiết bị mới. Tuy nhiên, mặc dù RT-PCR thời gian thực đã giải quyết nhiều khó khăn vốn có trong RT-PCR thông thường, nó đã trở nên ngày càng rõ ràng rằng nó tạo ra những vấn đề mới cần giải quyết cấp thiết. Do đó, bên cạnh việc cung cấp bức tranh tổng thể về công nghệ RT-PCR thời gian thực, bài đánh giá này còn có mục tiêu bổ sung: sẽ mô tả và thảo luận cụ thể một số vấn đề liên quan đến việc giải thích các kết quả có tính chất số học và dễ dàng phân tích thống kê, nhưng độ chính xác của chúng bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự biến đổi của hóa chất và người điều hành.

Giới tính kiểu hình của nhiều loài cá vây tia, bao gồm cả cá bơn, có thể được thay đổi một cách thực nghiệm bằng cách điều trị phôi hoặc ấu trùng dưới các nhiệt độ khác nhau hoặc hormone steroid giới tính. Để phân tích cơ chế xác định giới tính, đặc biệt là vai trò của cytochrome P450 aromatase (P450arom), một loại enzyme xúc tác chuyển đổi các androgen thành estrogen, trong sự khác biệt giới tính của tuyến sinh dục phụ thuộc vào nhiệt độ ở cá bơn Nhật Bản, chúng tôi đã tạo ra hai quần thể ấu trùng, cả hai đều có kiểu gen XX (cái di truyền) nhưng mỗi quần thể lớn lên để biểu hiện tất cả là cái kiểu hình hoặc đực kiểu hình, bằng cách nuôi dưỡng ấu trùng ở nhiệt độ nước bình thường (18 độ C) hoặc cao (27 độ C) từ ngày 30 đến 100 sau khi nở. Những ấu trùng (XX) được sản xuất nhân tạo bằng cách giao phối giữa những con cái bình thường (XX) với những con đực lưỡng bội sinh sản (XX) đã bị chuyển giới thành đực kiểu hình bằng 17alpha-methyltestosterone. Để nghiên cứu vai trò của P450arom trong xác định giới tính ở cá bơn, chúng tôi đã phân lập một cDNA P450arom chứa khung đọc mở hoàn chỉnh từ buồng trứng. RT-PCR cho thấy mRNA P450arom được biểu hiện cao ở buồng trứng và lách nhưng chỉ yếu ở tinh hoàn và não. Phân tích bán định lượng mRNA P450arom trong các tuyến sinh dục trong quá trình phân hóa giới tính cho thấy không có sự khác biệt về mức độ mRNA P450arom giữa nhóm cái và nhóm đực khi tuyến sinh dục còn không phân biệt giới tính (ngày 50 sau khi nở). Tuy nhiên, sau khi bắt đầu phân hóa giới tính (ngày 60), mức độ mRNA tăng nhanh chóng ở nhóm cái, trong khi chúng giảm nhẹ ở nhóm đực. Tương tự, mức estradiol-17beta tăng đáng kể ở nhóm cái, trong khi vẫn không thay đổi ở nhóm đực. Những kết quả này gợi ý rằng việc chuyển giới những ấu trùng cái di truyền thành đực kiểu hình bằng cách nuôi dưỡng chúng ở nhiệt độ nước cao đã gây ra sự ức chế biểu hiện gen P450arom. Hơn nữa, chúng tôi cho rằng việc duy trì mRNA P450arom ở mức rất thấp là điều kiện cần thiết cho sự phân hóa tinh hoàn, trong khi mức độ tăng là không thể thiếu cho sự phân hóa buồng trứng.

Các thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator (PPARs) là các thụ thể hormon hạt nhân, được miêu tả lần đầu tiên như là các mục tiêu phân tử cho các hợp chất tổng hợp gây ra sự gia tăng peroxisome. PPAR-gamma, thụ thể được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất trong số các PPARs, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh adipose và tăng cường độ nhạy insulin. Hơn nữa, PPAR-gamma đã được báo cáo là có ảnh hưởng đến các con đường phân chia/tuyến hóa tế bào trong nhiều loại ác tính khác nhau. Trong bài viết này, chúng tôi sẽ thảo luận về các tiến bộ gần đây trong việc hiểu biết chức năng của PPAR-gamma trong cả quá trình phân chia tế bào và phân hóa tế bào mỡ.

Các chất kích thích peroxisome (PPs) là hóa chất có tầm quan trọng trong công nghiệp và dược phẩm, gây ra ung thư gan qua cơ chế không di truyền. Một trong những đặc tính thú vị của PPs là các tác động đa dạng của những hợp chất này (bao gồm cả việc tăng tổng hợp DNA và sự tăng sinh peroxisome) chỉ được quan sát ở chuột và chuột lang, mà không có ở người. Việc hiểu rõ các nguy cơ đối với con người từ việc tiếp xúc với các hợp chất này trong môi trường và điều trị rất quan trọng, và điều này phụ thuộc vào việc hiểu các cơ chế ung thư gan không di truyền ở động vật gặm nhấm. Để hiểu sự thiếu nhạy cảm rõ rệt này ở con người, chú ý đã được hướng tới thụ thể được hoạt hóa bởi peroxisome proliferator alpha (PPARalpha), thụ thể này dường như trung gian cho các tác động của PPs ở gặm nhấm. Nó cũng được biết đến để trung gian cho các tác động hạ lipid máu mà các thuốc fibrate gây ra ở người có mức cholesterol và triglyceride huyết tương cao. Các thụ thể PPARalpha ở người có nhiều đặc điểm chức năng giống với các thụ thể ở động vật gặm nhấm, ở chỗ chúng có thể được kích hoạt phiên mã bởi PPs và điều chỉnh sự biểu hiện của một số gen nhất định. Tuy nhiên, một sự khác biệt chính là PPARalpha ít phong phú hơn ở gan người so với gan gặm nhấm, điều này đã dẫn đến gợi ý rằng sự khác biệt giữa các loài xuất phát từ sự khác biệt định lượng trong sự biểu hiện gene. Trong bài đánh giá này, chúng tôi mô tả các tác động của PPs và những gì được biết về các cơ chế tác động phân tử cũng như sự khác biệt giữa các loài liên quan đến gặm nhấm và con người. Sẽ chú ý đến sự khác biệt về lượng PPARalpha giữa các loài cũng như các khía cạnh 'chất lượng' trong việc điều chỉnh gene do PPARalpha trung gian, điều này cũng có thể giải thích việc kích hoạt một số gen và không kích hoạt những gen khác trong gan người do PPs gây ra.

Chúng tôi đã tổng hợp và nghiên cứu khả năng của một loạt bảy dẫn xuất mới 1α,25(OH)₂ vitamin D₃ trong việc ức chế sự phát triển nhân giống của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP, PC-3 và DU-145). Việc thêm liên kết đôi và ba vào vòng C/D (C-16) và chuỗi bên (C-22 và C-23) cũng như việc kéo dài chuỗi bên rất quan trọng cho hoạt tính tăng cường đối với LNCaP và PC-3. Sự định hướng lại của chuỗi bên trong cấu hình 20-epi dẫn đến các dẫn xuất cực kỳ mạnh chỉ chống lại LNCaP (ED₅₀ ≈ 5 × 10⁻¹¹ m). Các hợp chất với sáu fluor ở đầu chuỗi bên có hoạt tính rất mạnh chống lại cả PC-3 và LNCaP (ED₅₀ ≈ 2 × 10⁻⁸ m). Các tế bào DU-145 tương đối kháng với các hợp chất có tất cả các sửa đổi này, nhưng khi loại bỏ C-19 (ví dụ: 1,25(OH)₂-16-ene-23-yne-26,27-F₆-19-nor-D₃) dẫn đến một dẫn xuất có khả năng ức chế tất cả ba dòng tế bào tuyến tiền liệt. Phân tích thêm cho thấy rằng việc phơi nhiễm tạm thời (3 ngày, 10⁻⁷ m) với dẫn xuất này đã đủ để ức chế sự phát triển nhân giống của tế bào PC-3 bằng 50%. Phơi nhiễm tương tự cũng gây ra việc kìm hãm chu kỳ tế bào của tất cả ba dòng tế bào, đi kèm với sự tăng cường biểu hiện protein của chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (CDKI) được biết đến với tên gọi p21^waf1 trong cả ba dòng tế bào, và CDKI được biết đến với tên gọi p27^kip1 trong các tế bào LNCaP. Liên quan đến sự tăng cường các CDKI này, hiện tượng phân hóa một phần xảy ra, được đo bằng việc tăng cường biểu hiện của cả kháng nguyên cụ thể của tuyến tiền liệt ở tế bào LNCaP và E-cadherin, một protein liên kết tế bào có thể hoạt động như một chất ức chế khối u dự kiến (tế bào LNCaP và PC-3). Tóm tắt, đây là báo cáo đầu tiên về một loạt các dẫn xuất 19-nor-vitamin D₃ có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt LNCaP, PC-3 và DU-145. Các hợp chất này có thể làm trung gian cho các hoạt động ức chế tăng trưởng mạnh mẽ của chúng thông qua một con đường kìm hãm chu kỳ tế bào.

Proteolysis giới hạn của hầu hết các tiền chất protein lớn được thực hiện trong cơ thể bởi các chuyển thể pro-protein giống subtilisin. Nhiều quá trình sinh học quan trọng như tổng hợp hormone peptide, xử lý protein virus và trưởng thành của thụ thể liên quan đến sự xử lý proteolytic bởi các enzyme này, làm cho chúng trở thành các mục tiêu tiềm năng cho sự phát triển của các chất điều trị mới. Tuy nhiên, sự phát triển hiệu quả của các phân tử như vậy đòi hỏi một hiểu biết sâu sắc hơn về các cơ chế phân tử của quá trình xử lý protein proteolytic. Trong bài viết này, chúng tôi xem xét những phát hiện gần đây nhất về các khía cạnh phân tử của hoạt động chuyển thể giống subtilisin, chẳng hạn như phân tích cấu trúc của các protease, các cơ chế đặc hiệu enzyme/substrate, sự tương tác của chúng với các protein khác như 7B2, và sự phân bố mô và tế bào so sánh của các enzyme và các substrate của chúng. Dữ liệu này sau đó được sử dụng làm nền tảng cho việc xem xét các chức năng sinh học đã biết của các chuyển thể pro-protein giống subtilisin, các trường hợp lâm sàng đã báo cáo liên quan đến các khiếm khuyết trong xử lý proteolytic và, cuối cùng, việc phát triển các phân tử ức chế liệu pháp mới dựa trên kiến thức này.

Các bất thường trong chức năng buồng trứng, bao gồm sự bất thường trong sinh tinh và sự hình thành nang, là một thiếu hụt chính trong sinh sản nữ. Các bằng chứng ngày càng tăng trong tài liệu đã chỉ ra rằng các đường dẫn tín hiệu PI3K/PTEN/Akt và TSC/mTOR là những yếu tố điều chỉnh quan trọng chức năng buồng trứng, bao gồm sự ngủ đông, kích hoạt và tồn tại của các nang nguyên thủy, sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào nang, cũng như sự trưởng thành giảm nhiễm của trứng. Sự rối loạn trong các đường dẫn tín hiệu này có thể góp phần vào tình trạng vô sinh do sự phát triển nang bị suy yếu, sự phát triển trứng trong nang, và sự rụng trứng. Bài báo này tổng quan về trạng thái hiện tại của kiến thức về vai trò chức năng của các đường dẫn PI3K/PTEN/Akt và TSC/mTOR trong quá trình sinh tinh và hình thành nang ở động vật có vú và mối quan hệ của chúng với vô sinh nữ.

Enzym aromatase P-450 (P450arom) xúc tác quá trình chuyển đổi androgen thành estrogen. Một đoạn cDNA mã hóa P450arom đã được tách từ thư viện cDNA của buồng trứng cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss). Đoạn này đã được giải trình tự và phát hiện có một khung đọc mở dự đoán mã hóa cho một protein có 522 dư lượng amino acid. Polypeptide suy diễn có độ tương đồng 52% với P450arom của người, chuột và chuột lang, và 53% với của gà. Đoạn đã được xác nhận mã hóa P450arom bằng cách đưa nó vào các tế bào khối u thận khỉ COS-1 (tế bào COS-1) và phát hiện sự chuyển đổi testosterone thành oestradiol-17β bằng phương pháp đo miễn dịch phóng xạ. Vùng đầu N của polypeptide suy diễn dài hơn 19 amino acid so với các loài còn lại và được phát hiện bằng đồ thị độ ưa nước là rất kị nước.

Phân tích Northern blot cho thấy có các bản sao RNA dài 2.6kb có mặt trong buồng trứng cá hồi trong quá trình vitellogenesis và đã kết hợp với đoạn cDNA. Trong các mẫu từ các giai đoạn phát triển buồng trứng tiếp theo, không có bản sao RNA nào kết hợp với đầu dò. Vì các bản sao RNA chỉ có mặt trong giai đoạn sản xuất oestradiol-β bởi các nang trứng, sản xuất oestradiol-17β có thể được điều chỉnh, một phần, bởi lượng mRNA P450arom có mặt.

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các đồng hình của gen IGF-I và IGF-II ở động vật có vú cũng được tìm thấy ở cá xương. Chúng tôi báo cáo ở đây các cDNA mã hóa cho IGF-I và IGF-II được phân lập từ cá chẽm, Sparus aurata. So sánh chuỗi nucleotide cho thấy cả hai IGF đều được bảo tồn tốt giữa các loài cá xương, mặc dù IGF-I của Sparus ngắn hơn ba acid amin do bị rút ngắn các miền B và C. Sử dụng các cDNA đã phân lập làm mồi, mức biểu hiện tương đối của mRNA IGF-I và IGF-II đã được phân tích trong các mô khác nhau của Sparus. Gan của Sparus rõ ràng chứa mức độ mRNA IGF-I cao nhất trong khi mức độ mRNA IGF-II cũng tương đối cao được tìm thấy ở gan, tim và mang thông qua xét nghiệm bảo vệ ribonuclease. Sau khi tiêm GH, lượng mRNA IGF-I đã tăng 220% trong gan nhưng không phát hiện sự thay đổi nào ở mức độ mRNA IGF-II trong bất kỳ mô nào. Chúng tôi cũng đã phân tích biểu hiện của IGF-I và IGF-II trong Sparus trong giai đoạn phát triển sớm. Mức độ mRNA IGF-II cao nhất ở ấu trùng 1 ngày sau nở và giảm dần. Ngược lại, mRNA IGF-I được phát hiện ở ấu trùng 1 ngày tuổi nhưng có sự gia tăng trong biểu hiện ở ấu trùng 12 và 16 ngày tuổi. Những kết quả này cho thấy rằng biểu hiện của IGF-I và IGF-II được điều chỉnh chặt chẽ ở cá xương và gợi ý rằng chúng đóng vai trò khác nhau trong quá trình tăng trưởng và phát triển.