Journal of Histochemistry and Cytochemistry

Việc sử dụng tương tác avidin-biotin trong các kỹ thuật miễn dịch enzym cung cấp một phương pháp đơn giản và nhạy cảm để định vị kháng nguyên trong các mô được cố định bằng formalin. Trong số nhiều phương pháp nhuộm có sẵn, phương pháp ABC, liên quan đến việc áp dụng kháng thể thứ cấp được gán nhãn biotin, tiếp theo là sự bổ sung của phức hợp avidin-biotin-peroxidase, mang lại kết quả vượt trội so với phương pháp dùng kháng thể không được gán nhãn. Sự sẵn có của các vị trí gắn biotin trong phức hợp được tạo ra bởi việc ủ một lượng tương đối dư thừa avidin với peroxidase được gán nhãn biotin. Trong quá trình hình thành phức hợp, avidin đóng vai trò như một cầu nối giữa các phân tử peroxidase được gán nhãn biotin; và các phân tử peroxidase được gán nhãn biotin, có chứa nhiều nhóm biotin, hoạt động như một liên kết giữa các phân tử avidin. Do đó, một phức hợp "lattice" chứa nhiều phân tử peroxidase có khả năng được hình thành. Việc gắn kết phức hợp này với các nhóm biotin liên quan đến kháng thể thứ cấp dẫn đến cường độ nhuộm cao.

Các giai đoạn đầu tiên của quá trình hấp thụ peroxidase cây cải đuôi tiêm tĩnh mạch trong các ống thận gần của chuột đã được nghiên cứu bằng một kỹ thuật cytochemical cấu trúc siêu vi mới. Ở những con vật bị giết chỉ 90 giây sau khi tiêm, sản phẩm phản ứng được tìm thấy trên màng bờ chải và trong các chỗ hõm ống ở đỉnh. Từ các cấu trúc này, nó được vận chuyển đến các không bào đỉnh, nơi nó được tập trung dần để hình thành các giọt hấp thu protein. Phương pháp này, sử dụng 3,3'-diaminobenzidine làm chất nền có thể oxi hóa, cho phép định vị sắc nét và có độ nhạy cao. Hệ thống này rất thuận lợi trong việc nghiên cứu các giai đoạn đầu tiên của việc hấp thu protein qua ống thận, vì lượng nhỏ protein trên màng và trong ống cũng như các túi có thể dễ dàng phát hiện. Phương pháp này cũng cho thấy tiềm năng trong việc nghiên cứu sự vận chuyển protein ở nhiều loại tế bào và mô khác nhau.

Kháng nguyên đã được xác định bằng phương pháp hóa mô không sử dụng kháng thể được đánh dấu thông qua việc áp dụng tuần tự (a) huyết thanh thỏ đặc hiệu, (b) huyết thanh cừu đối với immunoglobulin G của thỏ, (c) phức hợp peroxidase củ cải đường- kháng peroxidase củ cải đường đã được tinh sạch cụ thể (PAP), (d) 3,3'-diaminobenzidine và hydro peroxide và (e) osmi tetroxide. Một phương pháp đơn giản để chuẩn bị PAP có năng suất cao bao gồm việc kết tủa kháng thể từ huyết thanh thỏ đặc hiệu với peroxidase củ cải đường (PO) theo tỷ lệ tương đương, hòa tan kết tủa đã rửa bằng PO dư thừa tại pH 2.3, 1°C, sau đó ngay lập tức trung hòa và tách PAP khỏi PO bằng nửa bão hòa với amoni sulfat. Tỷ lệ PO so với anti-PO trong PAP là 3:2 bất kể nguồn gốc của huyết thanh. PAP là không đồng nhất trên điện di, đồng nhất trên lắng đọng, khuếch tán và kính hiển vi điện tử và bao gồm các hình ngũ giác với đường kính 205 Å. s_{20, w}, 11.98 x 10^–13; d_{20, w}, 2.48 x 10^–7; trọng lượng phân tử theo vận tốc lắng đọng, 429,000, và cân bằng, 413,000. Độ nhạy và độ đặc hiệu của nhuộm miễn dịch hóa mô đối với spirochetes khoảng 100 đến 1000 lần so với miễn dịch huỳnh quang. Tỷ lệ bất ngờ của PO đối với anti-PO được cho là do sự ổn định bởi hình dạng ngũ giác, trong đó ba góc được nghi ngờ có thể là PO và hai mảnh kháng thể Fc.

Tetramethyl benzidine (TMB) là một chromogen có khả năng không gây ung thư có khả năng tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh tại các vị trí hoạt động của horseradish peroxidase. Sáu mươi sáu thủ tục khác nhau đã được thực hiện trên chuột và khỉ để xác định các thông số ủ tối ưu cho TMB. Kết quả, một thủ tục được khuyến nghị với độ nhạy vượt trội hơn nhiều so với phương pháp benzidine dihydrochloride đã được miêu tả trước đó. Thực tế, độ nhạy của phương pháp mới này trong việc chứng minh sự vận chuyển ngược rất vượt trội so với phương pháp benzidine dihydrochloride đã được miêu tả trước đó. Hơn nữa, nhờ vào độ nhạy được cải thiện này, nhiều kết nối efferent của vị trí tiêm cũng được hình dung. Vị trí tiêm được thể hiện bằng thủ tục TMB này lớn hơn đáng kể so với vị trí được thể hiện khi sử dụng benzidine dihydrochloride hoặc diaminobenzidine làm chromogen. Cuối cùng, thủ tục TMB này đã được so sánh với hai thủ tục TMB khác và được tìm thấy cung cấp cả hình thái và độ nhạy cao hơn.

Một kháng thể đơn dòng murine đặc hiệu cho phosphatase kiềm ruột bê đã được chuẩn bị và sử dụng trong kỹ thuật cầu kháng thể không gắn nhãn để gán nhãn cho các kháng thể đơn dòng. Quy trình này - phương pháp kháng thể đơn dòng kháng phosphatase kiềm (APAAP) - cung cấp gán nhãn miễn dịch tế bào tuyệt vời cho các lát mô và bã tế bào, so sánh độ rõ nét và cường độ với gán nhãn miễn dịch peroxidase. Nếu gán nhãn enzyme được phát triển với muối naphthol như một tác nhân kết hợp và Fast Red hoặc hexazotized new fuchsin như tác nhân bắt giữ, sản phẩm phản ứng đỏ sống động thu được rất dễ dàng phát hiện bằng mắt người. Vì lý do này, kỹ thuật APAAP được thấy đặc biệt phù hợp cho gán nhãn bã tế bào (cho cả kháng nguyên dịch bào và màng bề mặt) và để phát hiện số lượng tế bào mang kháng nguyên thấp trong một mẫu (ví dụ: tế bào ung thư trong dịch màng ác tính). Đã phát hiện rằng có thể tăng cường cường độ phản ứng gán nhãn APAAP một cách đáng kể bằng cách lặp lại các bước ủ thứ hai và thứ ba (tức là, kháng thể "cầu" không gắn nhãn và phức hợp APAAP). Kỹ thuật APAAP vượt trội hơn gán nhãn miễn dịch peroxidase cho việc nhuộm các mô giàu peroxidase nội sinh, và có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp miễn dịch peroxidase để nhuộm miễn dịch enzym kép. Phương pháp cũng có thể áp dụng để phát hiện các phân tử kháng nguyên sau khi chúng được chuyển điện di từ gel SDS-polyacrylamide sang tấm nitrocellulose ("immunoblotting").

Phản ứng dưới điều kiện nhẹ giữa formaldehyde và các dẫn xuất của phenylalanine và phenylethylamine đã được nghiên cứu. Khi các amine có trong một lớp protein khô được tiếp xúc với hơi formaldehyde, một hiện tượng phát quang rất mạnh từ xanh đến vàng chỉ được tạo ra bởi những amine mà không chỉ là amine bậc một mà còn có nhóm hydroxyl tại vị trí 3 và 4 (3,4-dihydroxyphenylalanine, dopamine, noradrenaline). Nhóm 3-OH dường như cần thiết cho phản ứng. Các catechol amines, mà là amine bậc hai (adrenaline, epinine), cho ra hiện tượng phát quang yếu hơn nhiều và phát triển một cách chậm hơn.

Các kết quả thu được từ quá trình kiểm tra thêm về phản ứng ủng hộ quan điểm rằng các amine chủ yếu ngưng tụ với formaldehyde để tạo ra 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolines, mà liên quan đến một phản ứng thứ cấp để trở nên có tính phát quang cao và đồng thời không hòa tan. Phản ứng thứ cấp này có thể là sự liên kết với protein, và oxy hóa với sự hình thành liên kết đôi trong vòng dị vòng, hoặc cả hai.

Một phương pháp mới trong việc gắn peroxidase củ cải đường với các protein đã được phát triển. Phân đoạn carbohydrate của peroxidase bị chặn bằng fluorodinitrobenzene đã được oxi hóa bằng natri periodat để tạo ra các nhóm aldehyde. Peroxidase-aldehyde sau đó được gắn một cách đơn hướng tới các nhóm amino tự do của protein với hiệu suất cao. Kháng thể mang peroxidase vẫn giữ được hoạt động miễn dịch cũng như hoạt động enzym của nó.

Một nhóm các tế bào nội tiết xem ra không liên quan, một số nằm trong các tuyến nội tiết, số khác trong các mô không phải nội tiết, chia sẻ một số đặc điểm về hóa sinh và cấu trúc siêu vi. Những đặc điểm này, từ bốn chữ cái đầu tiên mà từ APUD được phát sinh, chỉ ra việc có chung một mô hình trao đổi chất và các cơ chế tổng hợp, lưu trữ và bài tiết chung. Có giả thuyết rằng các đặc điểm khác nhau phản ánh việc sản xuất và lưu trữ protein tiền hormone có dạng xoắn ngẫu nhiên chủ yếu. Có thể có một số giải thích cho các đặc điểm APUD, nhưng nếu thực sự các tế bào này có chung một tổ tiên thì ứng cử viên khả thi duy nhất là tế bào chóp thần kinh.