PHƯƠNG PHÁP ENZYME KHÔNG GHI NHÃN TRONG CHUẨN BỊ VÀ TÍNH CHẤT CỦA PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ (HORSE-RADISH PEROXIDASE-ANTI-HORSE-RADISH PEROXIDASE) VÀ VIỆC SỬ DỤNG NÓ TRONG NHẬN DIỆN SPIROCHETES

Kháng nguyên đã được xác định bằng phương pháp hóa mô không sử dụng kháng thể được đánh dấu thông qua việc áp dụng tuần tự (a) huyết thanh thỏ đặc hiệu, (b) huyết thanh cừu đối với immunoglobulin G của thỏ, (c) phức hợp peroxidase củ cải đường- kháng peroxidase củ cải đường đã được tinh sạch cụ thể (PAP), (d) 3,3'-diaminobenzidine và hydro peroxide và (e) osmi tetroxide. Một phương pháp đơn giản để chuẩn bị PAP có năng suất cao bao gồm việc kết tủa kháng thể từ huyết thanh thỏ đặc hiệu với peroxidase củ cải đường (PO) theo tỷ lệ tương đương, hòa tan kết tủa đã rửa bằng PO dư thừa tại pH 2.3, 1°C, sau đó ngay lập tức trung hòa và tách PAP khỏi PO bằng nửa bão hòa với amoni sulfat. Tỷ lệ PO so với anti-PO trong PAP là 3:2 bất kể nguồn gốc của huyết thanh. PAP là không đồng nhất trên điện di, đồng nhất trên lắng đọng, khuếch tán và kính hiển vi điện tử và bao gồm các hình ngũ giác với đường kính 205 Å. s_{20, w}, 11.98 x 10^–13; d_{20, w}, 2.48 x 10^–7; trọng lượng phân tử theo vận tốc lắng đọng, 429,000, và cân bằng, 413,000. Độ nhạy và độ đặc hiệu của nhuộm miễn dịch hóa mô đối với spirochetes khoảng 100 đến 1000 lần so với miễn dịch huỳnh quang. Tỷ lệ bất ngờ của PO đối với anti-PO được cho là do sự ổn định bởi hình dạng ngũ giác, trong đó ba góc được nghi ngờ có thể là PO và hai mảnh kháng thể Fc.