Journal of Histochemistry and Cytochemistry

Nitric oxide synthases (NOS Types I-III) generate nitric oxide (NO), which in turn activates soluble guanylyl cyclase (GC-S). The distribution of this NO-mediated (nitrinergic) signal transduction pathway in the body is unclear. A polyclonal monospecific antibody to rat cerebellum NOS-I and a monoclonal antibody to rat lung GC-S were employed to localize the protein components of this pathway in different rat organs and tissues. We confirmed the localization of NOS-I in neurons of the central and peripheral nervous system, where NO may regulate cerebral blood flow and mediate long-term potentiation. GC-S was located in NOS-negative neurons, indicating that NO acts as an intercellular signal molecule or neurotransmitter. However, NOS-I was not confined to neurons but was widely distributed over several non-neural cell types and tissues. These included glia cells, macula densa of kidney, epithelial cells of lung, uterus, and stomach, and islets of Langerhans. Our findings suggest that NOS-I is the most widely distributed isoform of NOS and, in addition to its neural functions, regulates secretion and non-vascular smooth muscle function. With the exception of bone tissue, NADPH-diaphorase (NADPH-d) activity was generally co-localized with NOS-I immunoreactivity in both neural and non-neural cells, and is a suitable histochemical marker for NOS-I but not a selective neuronal marker.

Cyclosporine A (CsA) is the first immunosuppressant used in allotransplantation. Its use is associated with side effects that include nephrotoxicity. This study explored the anatomic structures involved in CsA nephrotoxicity and the effect of heme oxygenase (HO) in preventing CsA injury. Rats were divided into four groups, which were treated with olive oil, CsA (15 mg/kg/day), CsA plus the HO inhibitor (SnMP; 30 μM/kg/day), and with the HO inducer (CoPP; 5 mg/100 g bw). Renal tissue was treated for morphological, biochemical, and immunohistochemical studies. CsA-treated rats showed degenerative changes with renal fibrosis localized mainly around proximal tubules. Collapsed vessels were sometimes seen in glomeruli. No HO-1 expression and increased expression of endothelin-1 (ET-1) were observed in CsA-treated rats compared with controls. In CsA plus SnMP-treated rats, HO-1 expression was further reduced and the morphology was not changed compared to the CsA group, whereas CsA plus CoPP-treated animals again showed normal morphology and with restoration and an increase in HO-1 levels. HO activity and immunohistochemical data showed similar alterations as HO expression. No changes were observed for HO-2 analysis. The observations indicate that HO-1 downregulation and ET-1 upregulation by CsA might be one mechanism underlying CsA-induced nephrotoxicity. Therefore, attempts to preserve HO levels attenuate CsA nephrotoxicity.

Recent studies suggest that carbon monoxide (CO), which is formed by the enzyme heme oxygenase (HO) during the conversion of heme to biliverdin, shares some of the chemical and biological properties of nitric oxide (NO) and may play roles similar to those of NO. Heme oxygenase activity in the kidney has been reported for many years, and there are some reports on the expression of mRNA for two HO isozymes (HO-1 and HO-2) and cellular localization of HO-1 protein. However, cellular localization of HO-2 protein in the kidney under normal conditions has not been reported. In the present study we examined the expression and distribution of HO-2 mRNA and HO-2 protein in rat kidney using RNA protection assay and light and electron immunocytochemistry. RNA protection assay confirmed constitutive expression of HO-2 transcript in rat kidney. HO-2 immunoreactivity was selectively found in epithelial cells of the thick ascending limb and distal convoluted tubule, connecting tubule cells, and principal cells of the collecting duct. These results suggest that HO-2 is synthesized in the kidney and that HO-2 in the epithelial cells of renal tubules may serve as a source for CO generation under normal conditions.

In situ zymography is a method for the detection and localization of enzymatic activity in tissue sections. This method is used with frozen sections because routine fixation of tissue in neutral-buffered formalin inhibits enzyme activity. However, frozen sections present with poor tissue morphology, making precise localization of enzymatic activity difficult to determine. Ethanol- and zinc-buffered fixative (ZBF) are known to preserve both morphological and functional properties of the tissue well, but it has not previously been shown that these fixatives preserve enzyme activity. In the present study, we show that in situ zymography can be performed on ethanol- and ZBF-fixed paraffin-embedded tissue. Compared with snap-frozen tissue, ethanol- and ZBF-fixed tissue showed stronger signals and superior morphology, allowing for a much more precise detection of gelatinolytic activity. Gelatinolytic enzymes could also be extracted from both ethanol- and ZBF-fixed tissue. The yield, as analyzed by SDS-PAGE gelatin zymography and Western blotting, was influenced by the composition of the extraction buffer, but was generally lower than that obtained from unfixed tissue.

Một nhóm các tế bào nội tiết xem ra không liên quan, một số nằm trong các tuyến nội tiết, số khác trong các mô không phải nội tiết, chia sẻ một số đặc điểm về hóa sinh và cấu trúc siêu vi. Những đặc điểm này, từ bốn chữ cái đầu tiên mà từ APUD được phát sinh, chỉ ra việc có chung một mô hình trao đổi chất và các cơ chế tổng hợp, lưu trữ và bài tiết chung. Có giả thuyết rằng các đặc điểm khác nhau phản ánh việc sản xuất và lưu trữ protein tiền hormone có dạng xoắn ngẫu nhiên chủ yếu. Có thể có một số giải thích cho các đặc điểm APUD, nhưng nếu thực sự các tế bào này có chung một tổ tiên thì ứng cử viên khả thi duy nhất là tế bào chóp thần kinh.

Một phương pháp mới trong việc gắn peroxidase củ cải đường với các protein đã được phát triển. Phân đoạn carbohydrate của peroxidase bị chặn bằng fluorodinitrobenzene đã được oxi hóa bằng natri periodat để tạo ra các nhóm aldehyde. Peroxidase-aldehyde sau đó được gắn một cách đơn hướng tới các nhóm amino tự do của protein với hiệu suất cao. Kháng thể mang peroxidase vẫn giữ được hoạt động miễn dịch cũng như hoạt động enzym của nó.

Phản ứng dưới điều kiện nhẹ giữa formaldehyde và các dẫn xuất của phenylalanine và phenylethylamine đã được nghiên cứu. Khi các amine có trong một lớp protein khô được tiếp xúc với hơi formaldehyde, một hiện tượng phát quang rất mạnh từ xanh đến vàng chỉ được tạo ra bởi những amine mà không chỉ là amine bậc một mà còn có nhóm hydroxyl tại vị trí 3 và 4 (3,4-dihydroxyphenylalanine, dopamine, noradrenaline). Nhóm 3-OH dường như cần thiết cho phản ứng. Các catechol amines, mà là amine bậc hai (adrenaline, epinine), cho ra hiện tượng phát quang yếu hơn nhiều và phát triển một cách chậm hơn.

Các kết quả thu được từ quá trình kiểm tra thêm về phản ứng ủng hộ quan điểm rằng các amine chủ yếu ngưng tụ với formaldehyde để tạo ra 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolines, mà liên quan đến một phản ứng thứ cấp để trở nên có tính phát quang cao và đồng thời không hòa tan. Phản ứng thứ cấp này có thể là sự liên kết với protein, và oxy hóa với sự hình thành liên kết đôi trong vòng dị vòng, hoặc cả hai.

Một kháng thể đơn dòng murine đặc hiệu cho phosphatase kiềm ruột bê đã được chuẩn bị và sử dụng trong kỹ thuật cầu kháng thể không gắn nhãn để gán nhãn cho các kháng thể đơn dòng. Quy trình này - phương pháp kháng thể đơn dòng kháng phosphatase kiềm (APAAP) - cung cấp gán nhãn miễn dịch tế bào tuyệt vời cho các lát mô và bã tế bào, so sánh độ rõ nét và cường độ với gán nhãn miễn dịch peroxidase. Nếu gán nhãn enzyme được phát triển với muối naphthol như một tác nhân kết hợp và Fast Red hoặc hexazotized new fuchsin như tác nhân bắt giữ, sản phẩm phản ứng đỏ sống động thu được rất dễ dàng phát hiện bằng mắt người. Vì lý do này, kỹ thuật APAAP được thấy đặc biệt phù hợp cho gán nhãn bã tế bào (cho cả kháng nguyên dịch bào và màng bề mặt) và để phát hiện số lượng tế bào mang kháng nguyên thấp trong một mẫu (ví dụ: tế bào ung thư trong dịch màng ác tính). Đã phát hiện rằng có thể tăng cường cường độ phản ứng gán nhãn APAAP một cách đáng kể bằng cách lặp lại các bước ủ thứ hai và thứ ba (tức là, kháng thể "cầu" không gắn nhãn và phức hợp APAAP). Kỹ thuật APAAP vượt trội hơn gán nhãn miễn dịch peroxidase cho việc nhuộm các mô giàu peroxidase nội sinh, và có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp miễn dịch peroxidase để nhuộm miễn dịch enzym kép. Phương pháp cũng có thể áp dụng để phát hiện các phân tử kháng nguyên sau khi chúng được chuyển điện di từ gel SDS-polyacrylamide sang tấm nitrocellulose ("immunoblotting").

Tetramethyl benzidine (TMB) là một chromogen có khả năng không gây ung thư có khả năng tạo ra sản phẩm phản ứng màu xanh tại các vị trí hoạt động của horseradish peroxidase. Sáu mươi sáu thủ tục khác nhau đã được thực hiện trên chuột và khỉ để xác định các thông số ủ tối ưu cho TMB. Kết quả, một thủ tục được khuyến nghị với độ nhạy vượt trội hơn nhiều so với phương pháp benzidine dihydrochloride đã được miêu tả trước đó. Thực tế, độ nhạy của phương pháp mới này trong việc chứng minh sự vận chuyển ngược rất vượt trội so với phương pháp benzidine dihydrochloride đã được miêu tả trước đó. Hơn nữa, nhờ vào độ nhạy được cải thiện này, nhiều kết nối efferent của vị trí tiêm cũng được hình dung. Vị trí tiêm được thể hiện bằng thủ tục TMB này lớn hơn đáng kể so với vị trí được thể hiện khi sử dụng benzidine dihydrochloride hoặc diaminobenzidine làm chromogen. Cuối cùng, thủ tục TMB này đã được so sánh với hai thủ tục TMB khác và được tìm thấy cung cấp cả hình thái và độ nhạy cao hơn.

Kháng nguyên đã được xác định bằng phương pháp hóa mô không sử dụng kháng thể được đánh dấu thông qua việc áp dụng tuần tự (a) huyết thanh thỏ đặc hiệu, (b) huyết thanh cừu đối với immunoglobulin G của thỏ, (c) phức hợp peroxidase củ cải đường- kháng peroxidase củ cải đường đã được tinh sạch cụ thể (PAP), (d) 3,3'-diaminobenzidine và hydro peroxide và (e) osmi tetroxide. Một phương pháp đơn giản để chuẩn bị PAP có năng suất cao bao gồm việc kết tủa kháng thể từ huyết thanh thỏ đặc hiệu với peroxidase củ cải đường (PO) theo tỷ lệ tương đương, hòa tan kết tủa đã rửa bằng PO dư thừa tại pH 2.3, 1°C, sau đó ngay lập tức trung hòa và tách PAP khỏi PO bằng nửa bão hòa với amoni sulfat. Tỷ lệ PO so với anti-PO trong PAP là 3:2 bất kể nguồn gốc của huyết thanh. PAP là không đồng nhất trên điện di, đồng nhất trên lắng đọng, khuếch tán và kính hiển vi điện tử và bao gồm các hình ngũ giác với đường kính 205 Å. s_{20, w}, 11.98 x 10^–13; d_{20, w}, 2.48 x 10^–7; trọng lượng phân tử theo vận tốc lắng đọng, 429,000, và cân bằng, 413,000. Độ nhạy và độ đặc hiệu của nhuộm miễn dịch hóa mô đối với spirochetes khoảng 100 đến 1000 lần so với miễn dịch huỳnh quang. Tỷ lệ bất ngờ của PO đối với anti-PO được cho là do sự ổn định bởi hình dạng ngũ giác, trong đó ba góc được nghi ngờ có thể là PO và hai mảnh kháng thể Fc.