Journal of Cell Biology

Các phương pháp nhúng nhựa epoxy của Glauert và Kushida đã được cải tiến để tạo ra các phương pháp nhúng nhanh chóng, tái lập được, và tiện lợi cho kính hiển vi điện tử. Các lát cắt rất chắc chắn và tổn thương mô giảm hơn so với phương pháp nhúng methacrylate.

Chết tế bào được lập trình (PCD) đóng vai trò quan trọng trong sinh học phát triển và duy trì trạng thái ổn định trong các mô liên tục tái tạo. Hiện tại, sự tồn tại của nó chủ yếu được suy ra từ điện di gel của một mẫu DNA cộng gộp, vì PCD đã được chứng minh là liên quan đến sự phân mảnh DNA. Dựa trên quan sát này, chúng tôi mô tả ở đây sự phát triển của một phương pháp để hình dung PCD tại mức độ tế bào đơn lẻ, trong khi vẫn bảo tồn kiến trúc mô. Các lát cắt mô học thông thường, được xử lý trước bằng protease, đã được đánh dấu ở đầu nick bằng poly dU biotinylated, sử dụng bởi enzym chuyển vị deoxy terminal, và sau đó được nhuộm bằng peroxidase liên hợp avidin. Phản ứng này là cụ thể, chỉ những nhân ở vị trí mà PCD được dự kiến xảy ra mới được nhuộm. Sàng lọc ban đầu bao gồm: ruột non và ruột già, biểu bì, mô lympho, buồng trứng, và các cơ quan khác. Phân tích chi tiết cho thấy quá trình này bắt đầu ở ngoại vi hạt nhân, tương đối ngắn (1-3 giờ từ khi bắt đầu đến khi loại bỏ tế bào) và PCD xuất hiện trong các mô theo từng cụm. Quy mô của PCD trong mô được phương pháp này tiết lộ lớn hơn đáng kể so với chết tế bào theo chế độ hình thái hạt nhân, và do đó mở ra con đường cho nhiều nghiên cứu đa dạng.

Một kỹ thuật mới sử dụng việc tuần hoàn liên tục dòng dịch perfusion của gan chuột trong tình trạng tại chỗ, lắc gan trong môi trường đệm in vitro, và lọc mô qua lưới nylon, đạt được việc chuyển đổi khoảng 50% gan thành các tế bào parenchymal nguyên vẹn, tách biệt. Các môi trường perfusion bao gồm: (a) dung dịch Hanks không chứa canxi có 0,05% collagenase và 0,10% hyaluronidase, và (b) dung dịch Hanks không chứa magiê và canxi có 2 mM ethylenediaminetetraacetate. Các nghiên cứu sinh hóa và hình thái học chỉ ra rằng các tế bào tách biệt này có khả năng sống sót. Chúng hô hấp trong môi trường có chứa ion canxi, tổng hợp glucose từ lactate, không thấm với inulin, không nhuộm bằng trypan blue, và giữ nguyên tính toàn vẹn cấu trúc của chúng. Kính hiển vi điện tử của các sinh thiết được lấy trong và sau khi perfusion cho thấy rằng các desmosome bị cắt đứt nhanh chóng. Các vùng chứa hemidesmosome của màng tế bào bị lún vào và có vẻ như bị chèn ra và di chuyển về phía trung tâm. Tuy nhiên, các kết nối chặt và ngắt vẫn tồn tại trên các tế bào nguyên vẹn, tách biệt, giữ lại các đoạn nhỏ của tế bào chất từ các tế bào parenchymal trước đó. Các tế bào không giữ kết nối chặt và ngắt thể hiện sự sưng phồng của các bào vacuole Golgi và các bào vacuole trong tế bào chất ngoại vi. Sự hình thành vacuole tế bào chất trong một tỷ lệ nhỏ các tế bào và sự mất potassium là những dấu hiệu duy nhất của tổn thương tế bào được phát hiện. Theo các tham số khác được đo, các tế bào tách biệt tương đương với các tế bào parenchymal gan bình thường tại chỗ về hình dáng và chức năng.

Heavy metals may be incorporated from solution into tissue sections for electron microscopy. The resulting increase in density of the tissue provides greatly enhanced contrast with minimal distortion. Relative densities of various structures are found to depend on the heavy metal ions present and on the conditions of staining. Certain hitherto unobserved details are revealed and some sort of specificity exists, although the factors involved are not yet understood.

Trái ngược với các tế bào biểu bì của chuột, tế bào keratinocyte của da người khá kháng lại sự biến đổi in vitro. Việc bất tử hóa đã được thực hiện bằng SV40 nhưng đã dẫn đến các dòng tế bào có sự khác biệt trong quá trình biệt hóa. Chúng tôi đã thiết lập một dòng tế bào biểu mô người được chuyển hóa tự phát từ da người trưởng thành, duy trì đầy đủ khả năng biệt hóa của biểu bì. Dòng tế bào HaCaT này rõ ràng là bất tử (hơn 140 lần chuyển đi), có kiểu hình được chuyển hóa in vitro (có khả năng clonogenic trên nhựa và trong agar) nhưng vẫn không gây khối u. Mặc dù có tiềm năng tăng trưởng không giới hạn và bị biến đổi, tế bào HaCaT, tương tự như keratinocyte bình thường, tái tạo lại một mô biểu bì có cấu trúc có trật tự và biệt hóa khi được cấy ghép lên chuột nude. Các keratin đặc hiệu cho quá trình biệt hóa (số 1 và 10) và các dấu hiệu khác (involucrin và filaggrin) được biểu hiện và định vị một cách thường xuyên. Do đó, HaCaT là dòng tế bào biểu mô vĩnh viễn đầu tiên từ da người trưởng thành thể hiện sự biệt hóa bình thường và cung cấp một công cụ hứa hẹn cho việc nghiên cứu sự điều chỉnh quá trình keratin hóa trong các tế bào người. Khi phân tích di truyền, dòng tế bào này cho thấy sự không ổn định di truyền (ban đầu là hypodiploid) với các nhiễm sắc thể đánh dấu ổn định duy nhất cho thấy nguồn gốc đơn dòng. Cơ sở xác định sự đúng đắn của dòng tế bào HaCaT với mô gốc đã được chứng minh bằng dấu vân tay DNA sử dụng các đầu dò minisatellite siêu biến đổi. Đây là sự chứng minh đầu tiên cho thấy mô hình dấu vân tay DNA không bị ảnh hưởng bởi quá trình nuôi cấy lâu dài, sự biến đổi và nhiều thay đổi nhiễm sắc thể, do đó cung cấp một khả năng độc đáo để xác định rõ ràng các dòng tế bào người. Các đặc điểm của dòng tế bào HaCaT tài liệu rõ ràng rằng sự chuyển hóa tự phát của keratinocyte người trưởng thành có thể xảy ra in vitro và liên quan đến các thay đổi nhiễm sắc thể liên tiếp, mặc dù không bắt buộc phải có các khuyết tật lớn trong các quá trình biệt hóa.

Một phương pháp mới đã được phát triển để chuẩn bị các văn hóa tế bào thần kinh đệm và oligodendrocyte gần như tinh khiết. Phương pháp này dựa trên (a) sự vắng mặt của các tế bào thần kinh sống trong các văn hóa được chuẩn bị từ não của chuột cống sau sinh, (b) sự phân lớp của các tế bào thần kinh đệm và oligodendrocyte trong văn hóa, và (c) sự tách biệt có chọn lọc các oligodendrocyte nằm trên cùng khi bị tác dụng bởi lực cắt do lắc các văn hóa trên máy lắc quỹ đạo trong 15-18 giờ ở 37 độ C. Các chế phẩm này có vẻ hơn 98% tinh khiết và chứa khoảng 1-2 x 10(7) tế bào sống (20-40 mg protein tế bào). Ba phương pháp đã được sử dụng để đặc trưng hóa hai loại văn hóa này. Đầu tiên, quy trình kính hiển vi điện tử được sử dụng để xác định các tế bào trong mỗi chế phẩm (văn hóa hỗn hợp và văn hóa tách rời của tế bào thần kinh đệm và oligodendrocyte) và để đánh giá độ tinh khiết của mỗi chế phẩm. Thứ hai, hai dấu ấn tế bào oligodendroglial, 2',3'-nucleotide chu kỳ 3'-phosphohydrolase (EC 3.1.4.37) và glycerol phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8) đã được giám sát. Thứ ba, sự điều chỉnh của sự tích lũy AMP vòng trong mỗi loại văn hóa đã được kiểm tra. Ngoài những nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của chiết xuất não và dibutyryl cAMP lên hình thái vĩ mô và cấu trúc siêu vi của mỗi chế phẩm. Những tác nhân này kích thích sự hình thành quá trình thần kinh đệm mà không có bất kỳ ảnh hưởng hình thái nào rõ ràng lên các oligodendrocyte. Tổng thể, các kết quả chỉ ra rằng các văn hóa tinh khiết của tế bào thần kinh đệm và oligodendrocyte có thể được chuẩn bị và duy trì. Những chế phẩm này sẽ hỗ trợ đáng kể trong nỗ lực khảo sát sinh hóa, sinh lý và hóa học dược phẩm của hai loại tế bào chính của hệ thần kinh trung ương này.

Tiểu đơn vị nhỏ (40S) của ribosom ở eukaryote được cho là sẽ liên kết ban đầu tại đầu 5'-capped của RNA thông tin và sau đó di chuyển, dừng lại tại codon AUG đầu tiên trong bối cảnh thuận lợi để khởi đầu quá trình dịch mã. Quy tắc AUG đầu tiên không phải là tuyệt đối, nhưng có những quy tắc để phá vỡ quy tắc này. Một số quan sát bất thường có vẻ mâu thuẫn với cơ chế quét giờ đây dường như là những hiện tượng giả. Một vài bất thường thực sự vẫn chưa được giải thích.

Việc phân tách các khối u MOPC 41 DL-1 đã chỉ ra rằng mRNA cho chuỗi nhẹ của immunoglobulin chỉ được định vị trong các ribosome liên kết với màng. Thực nghiệm cho thấy sản phẩm dịch mã của mRNA chuỗi nhẹ được tách ra trong một hệ thống tổng hợp protein dị hợp trong ống nghiệm lớn hơn chuỗi nhẹ tiết ra thực sự; điều này xác nhận các kết quả tương tự từ một số phòng thí nghiệm. Quá trình tổng hợp in vitro của một protein tiền phát của chuỗi nhẹ không phải là một sản phẩm giả tạo của dịch mã trong một hệ thống dị hợp, bởi vì đã chỉ ra rằng các polysome tách rời, được tách ra từ các microsome thô điều trị bằng chất tẩy rửa, không chỉ chứa các chuỗi nhẹ mới được hình thành đã được xử lý protein trong cơ thể mà còn chứa các chuỗi nhẹ chưa được xử lý. Việc hoàn thiện các chuỗi nhẹ mới này trong ống nghiệm dẫn đến việc tổng hợp một số chuỗi có cùng khối lượng phân tử như các chuỗi nhẹ tiết ra thực sự, vì do hoàn thiện các chuỗi đã được xử lý trong cơ thể và các chuỗi khác mà, do hoàn thiện các chuỗi chưa được xử lý, có cùng khối lượng phân tử với tiền phát của chuỗi nhẹ. Ngược lại, việc hoàn thiện các chuỗi nhẹ mới được chứa trong các microsome thô chỉ dẫn đến việc tổng hợp các chuỗi nhẹ đã được xử lý. Tổng hợp lại, các kết quả này chỉ ra rằng hoạt tính xử lý có mặt trong các microsome thô tách rời, rằng nó được định vị trong phần màng của các microsome thô, và, do đó, có khả năng đã được hòa tan trong quá trình điều trị bằng chất tẩy rửa được sử dụng để tách các polysome tách rời. Hơn nữa, các kết quả này đã xác lập rằng quá trình xử lý trong cơ thể diễn ra trước khi hoàn thiện chuỗi mới. Dữ liệu cũng chỉ ra rằng quá trình xử lý in vitro của các chuỗi mới bởi các microsome thô phụ thuộc vào việc ribosome gắn kết với màng. Nếu quá trình này bị can thiệp bởi axit aurintricarboxylic, các microsome thô cũng tổng hợp một số chuỗi chưa được xử lý. Dữ liệu được trình bày trong bài báo này đã được giải thích dưới ánh sáng của một giả thuyết mới được đề xuất. Giả thuyết này, được gọi là giả thuyết tín hiệu, sẽ được mô tả chi tiết hơn trong phần thảo luận.