Journal of Cell Biology

In response to an external stimulus, neuronal cells release neurotransmitters from small synaptic vesicles and endocrine cells release secretory proteins from large dense core granules. Despite these differences, endocrine cells express three proteins known to be components of synaptic vesicle membranes. To determine if all three proteins, p38, p65, and SV2, are present in endocrine dense core granule membranes, monoclonal antibodies bound to beads were used to immunoisolate organelles containing the synaptic vesicle antigens. [3H]norepinephrine was used to label both chromaffin granules purified from the bovine adrenal medulla and rat pheochromocytoma (PC12) cells. Up to 80% of the vesicular [3H]norepinephrine was immunoisolated from both labeled purified bovine chromaffin granules and PC12 postnuclear supernatants. In PC12 cells transfected with DNA encoding human growth hormone, the hormone was packaged and released with norepinephrine. 90% of the sedimentable hormone was also immunoisolated by antibodies to all three proteins. Stimulated secretion of PC12 cells via depolarization with 50 mM KCl decreased the amount of [3H]norepinephrine or human growth hormone immunoisolated. Electron microscopy of the immunoisolated fractions revealed large (greater than 100 nm diameter) dense core vesicles adherent to the beads. Thus, large dense core vesicles containing secretory proteins possess all three of the known synaptic vesicle membrane proteins.

The subcellular distribution of G protein subunits in the neutrophil was examined. Cells were nitrogen cavitated and subcellular organelles fractionated on discontinuous sucrose gradients. The presence of GTP-binding regulatory protein (G protein) alpha and beta/gamma subunits in each organelle was determined using three methods of analysis: specific binding of guanine nucleotide, ADP ribosylation by pertussis toxin, and immunoblot analysis with subunit-specific G protein antibodies. Both plasma membrane and cytosolic G protein components were detected. In contrast, neither the specific nor the azurophilic granules contained detectable G protein. Based on the ability of exogenous G protein beta/gamma subunits to increase the ADP ribosylation of the cytosolic form of G protein and upon the hydrodynamic behavior of the cytosolic protein, it is likely that this represents an uncomplexed G protein alpha subunit. Proteolytic mapping with Staphylococcus aureus V8 protease suggests the soluble alpha subunit is from Gn, the major pertussis toxin substrate of human neutrophils. Using quantitative analysis, the levels of the 40-kD G protein alpha subunit and of the 35/36-kD beta subunit in the neutrophil membrane were determined.

The Semliki Forest virus (SFV) directs the synthesis of a heterodimeric membrane protein complex which is used for virus membrane assembly during budding at the surface of the infected cell, as well as for low pH-induced membrane fusion in the endosomes when particles enter new host cells. Existing evidence suggests that the E1 protein subunit carries the fusion potential of the heterodimer, whereas the E2 subunit, or its intracellular precursor p62, is required for binding to the nucleocapsid. We show here that during virus uptake into acidic endosomes the original E2E1 heterodimer is destabilized and the E1 proteins form new oligomers, presumably homooligomers, with altered E1 structure. This altered structure of E1 is specifically recognized by a monoclonal antibody which can also inhibit penetration of SFV into host cells as well as SFV-mediated cell-cell fusion, thus suggesting that the altered E1 structure is important for the membrane fusion. These results give further support for a membrane protein oligomerization-mediated control mechanism for the membrane fusion potential in alphaviruses.

Nồng độ canxi ngoại bào đã được chứng minh là kiểm soát sự phân tầng của các tế bào keratinocytes nuôi cấy, có thể thông qua việc điều chỉnh sự hình thành các desmosome. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các tế bào keratinocytes nuôi trong môi trường chứa 0.1 mM Ca++ tạo thành các quần thể lỏng lẻo mà không có desmosome. Nếu nồng độ Ca++ được nâng lên 1 mM, các desmosome sẽ được lắp ráp và sự phân phối của các sợi keratin sẽ bị thay đổi. Chúng tôi đã kiểm tra sự phân bố của vinculin và actin trong các tế bào keratinocytes dưới các điều kiện tương tự. Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch, chúng tôi cho thấy rằng việc nâng cao [Ca++] trong môi trường làm thay đổi một cách đáng kể sự phân bố của vinculin và actin, dẫn đến sự hình thành các khớp nối kiểu kết dính trong vòng 15 phút sau khi chuyển sang môi trường có nồng độ canxi cao. Các biên của tế bào ở rìa của các quần thể, không gần gũi với các tế bào khác, không bị ảnh hưởng, trong khi các tế bào ở bên trong quần thể tạo ra các khớp nối xung quanh chu vi của mình. Các đĩa gắn kết trong các tế bào keratinocytes được nuôi trong môi trường canxi thấp nằm ở mặt bụng của tế bào, nhưng các khớp nối được hình thành sau khi chuyển sang canxi cao thì không, như được chỉ ra bởi kính hiển vi phản xạ nhiễu xạ. Trong các tế bào được dán nhãn đồng với các kháng thể chống lại vinculin và desmoplakin, các khớp nối kiểu kết dính có chứa vinculin đã hiển thị trước các khớp nối kiểu desmosome khi các tế bào được chuyển sang canxi cao. Mặc dù các cấu trúc mới hình thành chứa vinculin trong các tế bào canxi cao, giống như desmosome, đều đồng vị trí với các cấu trúc có mật độ pha dày, nhưng việc chồng ghép các hình ảnh huỳnh quang video bằng cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang số hóa cho thấy rằng các khớp nối kiểu kết dính và desmosome là các cấu trúc riêng biệt. Các khớp nối kiểu kết dính, giống như các desmosome, có thể đóng vai trò thiết yếu trong việc kiểm soát sự phân tầng của các tế bào keratinocytes.

Một giao diện của thiết bị phổ quang huỳnh quang vi mô của chúng tôi với một hệ thống xử lý hình ảnh thực hiện các phép đo phổ quang huỳnh quang vi mô trong các tế bào sống bằng cách xử lý hình ảnh kỹ thuật số. Các tham số quang phổ huỳnh quang có thể được đo bằng cách xử lý hình ảnh kỹ thuật số trực tiếp từ các hình ảnh vi mô của tế bào và được tự động chuẩn hóa cho chiều dài đường đi và thể tích có thể tiếp cận. Do đó, một "bản đồ" tế bào chất chính xác của các tham số quang phổ khác nhau có thể được tạo ra. Giá trị pH tế bào chất ở trạng thái nghỉ của tế bào nguyên bào (tế bào 3T3) đã được xác định bằng cách đo tỷ lệ huỳnh quang fluorescein được kích thích bởi hai bước sóng liên tiếp (489 và 452 nm). Dextran được gắn fluorescein tiêm vào tế bào được sử dụng làm chỉ số pH, vì nó bị kẹt trong tế bào chất nhưng không được vào nhân và các bào quan khác. Giá trị pH trung bình trong tế bào chất là 6.83 (+/- 0.38). Tuy nhiên, pH tế bào chất thể hiện một phân bố không đơn điệu, với giá trị pH trung bình thấp hơn là 6.74 (+/- 0.23). Khi tế bào 3T3 hấp thụ môi trường chứa dextran fluorescein, các pinosome ở ngoại vi nhân có pH thấp hơn so với những pinosome gần hơn với mép gấp nếp của tế bào. Hệ thống xử lý hình ảnh hiện tại được phân tích về độ tuyến tính của phát hiện, hiện tượng tán xạ ánh sáng, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, đường chuẩn, và độ phân giải không gian. Các kết quả thu được từ phân tích hình ảnh kỹ thuật số được chứng minh là có thể so sánh với các kết quả từ phổ quang huỳnh quang vi mô tiêu chuẩn. Chúng tôi cũng thảo luận về một số ứng dụng khác của kỹ thuật hình ảnh tỷ lệ này trong sinh học tế bào.

Vì sự quan trọng của các phân tử nhận diện thần kinh do tế bào glia biểu hiện trong việc trung gian các tương tác với tế bào thần kinh, các yếu tố tăng trưởng và cytokine được biết đến có chức năng trong quá trình hình thành mô và trong các bệnh lý của hệ thần kinh đã được nghiên cứu về tác động của chúng đối với sự biểu hiện các phân tử nhận diện bởi các tế bào sao chưa trưởng thành và trưởng thành từ nhiều vùng não khác nhau. Trong các nuôi cấy tế bào sao chưa trưởng thành, các yếu tố chuyển hóa tăng trưởng-beta 1 (TGF-beta 1) và -beta 2 (TGF-beta 2) cùng với yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) đã làm tăng sự biểu hiện của phân tử bám dính thần kinh L1, dẫn đến sự gia tăng đặc hiệu do glia điều hòa L1 trong quá trình mọc nhánh của các tế bào thần kinh hạch rễ lưng trên nền tế bào sao. Sự biểu hiện L1 do TGF-beta kích thích đã bị ngăn chặn khi bổ sung kháng thể chống lại NGF, cho thấy rằng TGF-beta ảnh hưởng đến sự biểu hiện L1 bằng cách điều chỉnh sản xuất NGF bởi các tế bào sao. TGF-beta 1 và -beta 2 đã làm giảm sự biểu hiện của N-CAM ở tế bào sao chưa trưởng thành. Vì sự biểu hiện N-CAM không bị ảnh hưởng bởi NGF và các kháng thể chống lại NGF không làm giảm đi sự giảm biểu hiện N-CAM do TGF-beta gây ra, NGF có vẻ không phải là chất trung gian điều tiết sự biểu hiện của N-CAM. Sự biểu hiện của phân tử bám dính trên tế bào glia (AMOG) không bị ảnh hưởng bởi bất kỳ yếu tố nào. NGF và TGF-beta 2 ở dạng tiềm tàng, nhưng không có TGF-beta 1, được tìm thấy trong dịch nuôi cấy. Việc bổ sung interferon-gamma (IFN-gamma), interleukin-1 beta (IL-1 beta), interleukin-6 (IL-6), yếu tố tăng trưởng xuất phát từ tiểu cầu (PDGF) hoặc yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (bFGF) vào các nuôi cấy không làm thay đổi sự biểu hiện các phân tử nhận diện. Sự biểu hiện các phân tử nhận diện bởi các tế bào sao trưởng thành không được tìm thấy bị biến đổi bởi bất kỳ yếu tố nào đã được thử nghiệm. Với sự quan sát rằng mức độ biểu hiện L1 và N-CAM tương quan với sự hiện diện của TGF-beta 2 và NGF trong dịch nuôi cấy của các tế bào sao chưa trưởng thành, một cơ chế điều chỉnh tự nội tại cho sự biểu hiện các phân tử nhận diện bởi các tế bào này được gợi ý là đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các tương tác giữa tế bào thần kinh và tế bào glia.

Nhân tế bào từ lâu được giả định đóng một vai trò vật lý quan trọng trong quá trình cực hóa và di chuyển của tế bào, nhưng vai trò đó chưa được định nghĩa hoặc kiểm tra một cách nghiêm ngặt. Ở đây, chúng tôi đã loại bỏ nhân tế bào để kiểm tra tính cần thiết về mặt vật lý của nhân trong quá trình cực hóa tế bào và di chuyển có hướng. Sử dụng các tế bào động vật có vú không nhân (tế bào bào chất), chúng tôi phát hiện ra rằng việc thiết lập cực và di chuyển tế bào trong một chiều (1D) và hai chiều (2D) xảy ra mà không cần đến nhân. Các tế bào bào chất di chuyển theo hướng về phía các tín hiệu ngoại bào hòa tan (hóa hướng) và bám bề mặt (haptotaxis) và di chuyển tập thể trong các thử nghiệm trầy xước. Nhất quán với các nghiên cứu trước đây, di chuyển trong môi trường 3D phụ thuộc vào nhân. Một phần, điều này có thể phản ánh lực tác động giảm của tế bào bào chất lên các bề mặt đàn hồi về mặt cơ học. Phản ứng này cũng được mô phỏng ở các tế bào có khiếm khuyết trong nhân-cytoskeleton và khi ức chế khả năng co bóp dựa trên actomyosin. Tóm lại, các quan sát của chúng tôi cho thấy rằng nhân là không cần thiết cho quá trình cực hóa và di chuyển trong 1D và 2D nhưng rất quan trọng cho các phản ứng cơ học của tế bào.

Di chuyển tế bào nằm ở trung tâm của việc hình thành, duy trì và tái tạo mô cũng như các tình trạng bệnh lý như xâm nhập ung thư. Các yếu tố cấu trúc và phân tử của cả môi trường mô và hành vi tế bào xác định xem các tế bào di chuyển một cách độc lập (thông qua các chế độ amip hoặc trung mô) hay một cách tập thể. Sử dụng một mô hình điều chỉnh đa tham số, chúng tôi mô tả cách kích thước, mật độ, độ cứng và phương hướng của ma trận ngoại bào cùng với các yếu tố xác định tế bào - bao gồm sự bám dính tế bào-tế bào và tế bào-ma trận, độ cực của cytoskeleton và độ cứng, và sự phân hủy protein quanh tế bào - tương tác lẫn nhau để kiểm soát chế độ di chuyển và hiệu quả. Các tế bào di động tích hợp các đầu vào biến đổi để điều chỉnh các tương tác giữa chúng với nhau và với ma trận nhằm xác định chế độ di chuyển. Mô hình điều chỉnh cung cấp một ma trận các tham số kiểm soát sự di chuyển của tế bào như một quá trình thích nghi và chuyển đổi lẫn nhau có liên quan đến các ngữ cảnh sinh lý và bệnh lý khác nhau.

Interferon-γ (IFN-γ) được cho là góp phần vào các rối loạn mất myelin do miễn dịch bằng cách nhắm mục tiêu vào oligodendrocyte sản xuất myelin, một loại tế bào rất nhạy cảm với sự gián đoạn tổng hợp protein và sự rối loạn của con đường bài tiết. Chúng tôi phát hiện rằng sự apoptosis do IFN-γ gây ra trong các tế bào oligodendrocyte nuôi cấy từ chuột đã liên quan đến căng thẳng lưới nội chất (ER). Căng thẳng ER cũng đi kèm với sự apoptosis của oligodendrocyte và tình trạng hypomyelination ở chuột chuyển gen biểu hiện không phù hợp IFN-γ trong hệ thần kinh trung ương (CNS). So với nền tảng di truyền kiểu hoang dã, việc tăng cường biểu hiện IFN-γ ở chuột mang đột biến mất chức năng ở kinase lưới nội chất tụy (PERK) đã làm giảm mạnh sự sống sót của động vật, thúc đẩy tình trạng hypomyelination trong CNS, và tăng cường sự mất mát của oligodendrocyte. PERK mã hóa một kinase do căng thẳng lưới nội chất kích thích, phosphoryl hóa yếu tố khởi đầu phiên mã eukaryote 2α và duy trì ổn định protein của khách hàng cụ thể trong lưới nội chất bị căng thẳng. Do đó, sự nhạy cảm quá mức của chuột PERK+/− với IFN-γ liên quan đến căng thẳng ER trong các rối loạn mất myelin do viêm CNS gây ra.