Insect Molecular Biology

Màng lưới tẩm pyrethroid đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sốt rét, đặc biệt trong các khu vực mà bệnh sốt rét ổn định. Hơn 90% tỷ lệ mắc bệnh sốt rét hàng năm hiện nay (khoảng 500 triệu trường hợp lâm sàng với tối đa 2 triệu ca tử vong) ở Châu Phi, nơi mà vector chính là Anopheles gambiae s.s. Do tình trạng kháng pyrethroid đã được báo cáo tại loài muỗi này, các kỹ thuật đơn giản và đáng tin cậy là rất cần thiết để đặc trưng hóa và giám sát sự kháng này trong thực địa. Ở côn trùng, một cơ chế quan trọng của kháng pyrethroid là do sự thay đổi của protein kênh natri mở cổng điện áp mà gần đây đã cho thấy có liên quan đến các đột biến của gen kênh natri loại para. Chúng tôi chứng minh rằng một trong những đột biến này có mặt ở một số chủng A. gambiae s.s. kháng pyrethroid và mô tả một kiểm tra chẩn đoán dựa trên PCR cho phép phát hiện nó trong bộ gen của các cá thể muỗi. Sử dụng kiểm tra này, chúng tôi đã phát hiện đột biến này trong sáu trên bảy mẫu thực địa từ Tây Phi, tần suất của nó tương quan chặt chẽ với khả năng sống sót khi tiếp xúc với pyrethroid. Kiểm tra chẩn đoán này sẽ mang lại cải thiện quan trọng cho việc giám sát thực địa kháng pyrethroid, trong khuôn khổ các chương trình kiểm soát sốt rét.

Glutathione transferases (GSTs) là một gia đình enzyme đa dạng được tìm thấy phổ biến ở các sinh vật hiếu khí. Chúng đóng vai trò trung tâm trong việc giải độc cả các hợp chất nội sinh và ngoại vi, đồng thời cũng tham gia vào việc vận chuyển trong tế bào, tổng hợp hormone và bảo vệ chống lại căng thẳng ôxy hóa. Mối quan tâm về GST ở côn trùng chủ yếu tập trung vào vai trò của chúng trong tình trạng kháng thuốc trừ sâu. GST có khả năng chuyển hóa thuốc trừ sâu bằng cách hỗ trợ quá trình khử dehydrochlor hóa hoặc thông qua các phản ứng liên hợp với glutathione đã khử, để tạo ra các chất chuyển hóa tan trong nước dễ dàng hơn để thải ra ngoài. Bên cạnh đó, chúng còn góp phần loại bỏ các gốc tự do oxy độc hại được sinh ra thông qua hoạt động của thuốc trừ sâu. Việc chú thích bộ gen của Anopheles gambiae và Drosophila melanogaster đã tiết lộ đầy đủ quy mô của gia đình enzyme này ở côn trùng. Bài đánh giá ngắn này mô tả gia đình enzyme GST ở côn trùng, tập trung cụ thể vào vai trò của chúng trong việc gây ra tình trạng kháng thuốc trừ sâu.

Một thử nghiệm thực địa về màn và rèm tẩm permethrin đã được khởi xướng tại miền Tây Kenya vào năm 1990, và một dòng Anopheles gambiae tỏ ra giảm nhạy cảm với permethrin đã được nhân giống từ địa điểm này vào năm 1992. Sự thay thế leucine–phenylalanine tại vị trí 1014 của kênh natri phụ thuộc điện áp là nguyên nhân gây ra kháng permethrin và DDT ở nhiều loài côn trùng, bao gồm cả Anopheles gambiae từ Tây Phi. Chúng tôi đã nhân bản và giải trình tự một đoạn cDNA kênh natri từ dòng kháng permethrin của Kenya và xác định sự thay thế khác (leucine thành serine) tại cùng một vị trí, liên quan đến sự di truyền kháng permethrin trong thế hệ F₂ từ các thế hệ lai di truyền giữa cá thể nhạy và kháng. Phản ứng chuỗi polymerase chuẩn đoán (PCR) được phát triển bởi Martinez‐Torres et al. [(1998) Insect Mol Biol 7: 179–184] để phát hiện các allele kdr trong quần thể thực địa của An. gambiae sẽ không phát hiện allele của Kenya và vì vậy dựa vào xét nghiệm này có thể dẫn đến đánh giá thấp sự phổ biến của kháng pyrethroid ở loài này. Chúng tôi đã điều chỉnh PCR chuẩn đoán để phát hiện đột biến leucine–serine và với chuẩn đoán này, chúng tôi đã chứng minh rằng allele kdr này đã có mặt trong các cá thể thu được từ địa điểm thử nghiệm Kenya vào năm 1986, trước khi màn tẩm pyrethroid được giới thiệu. Kênh natri của An. gambiae đã được định vị vật lý trên nhiễm sắc thể 2L, phân đoạn 20C. Vị trí này tương ứng với vị trí của một locus tính trạng định lượng chính quyết định khả năng kháng permethrin trong dòng An. gambiae của Kenya.

Khả năng kháng thuốc trừ sâu cao do acetylcholinesterase (AChE) không nhạy cảm đã xuất hiện ở muỗi. Một đột biến đơn lẻ (G119S của gen ace‐1) giải thích cho khả năng kháng thuốc trừ sâu cao này ở Culex pipiens và trong Anopheles gambiae. Để cung cấp tài liệu tốt hơn về gen ace‐1 và ảnh hưởng của đột biến G119S, chúng tôi trình bày một mô hình cấu trúc ba chiều của AChE, cho thấy rằng sự thay thế độc đáo này được định vị trong lỗ oxyanion, giải thích về tính không nhạy cảm với thuốc trừ sâu và sự can thiệp của nó với các chức năng xúc tác của enzyme. Khi G119S tạo ra một vị trí hạn chế, một thử nghiệm PCR đơn giản đã được xây dựng để phát hiện sự hiện diện của nó ở cả A. gambiae và C. pipiens, hai loài muỗi thuộc các tông khác nhau (Culicinae và Anophelinae). Có khả năng rằng đột biến này cũng giải thích cho khả năng kháng thuốc cao được tìm thấy ở các loài muỗi khác, và các kết quả hiện tại cho thấy rằng thử nghiệm PCR phát hiện đột biến G119S trong véc tơ sốt rét A. albimanus. Do đó, G119S đã xảy ra độc lập ít nhất bốn lần trong muỗi và thử nghiệm PCR này có khả năng áp dụng rộng rãi trong họ Culicidae.

Các loại thuốc pyrethroid thường được sử dụng làm thuốc diệt muỗi trưởng thành và sự phát triển kháng thuốc đối với các hợp chất này là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Kháng thuốc ‘Knockdown resistance’ (kdr) đối với pyrethroids thường do các đột biến không đồng nghĩa trong protein màng transmembrane kênh natri nhạy điện (para) làm giảm khả năng liên kết với pyrethroid. Việc phát hiện sớm kdr là rất quan trọng trong việc phát triển các chiến lược quản lý kháng thuốc ở muỗi, bao gồm Aedes aegypti, vector phổ biến nhất của virus sốt xuất huyết và virus sốt vàng. Brengues và cộng sự đã mô tả bảy đột biến mới trong đoạn 6 kỵ nước của miền II của para ở Ae. aegypti. Các thử nghiệm trên ấu trùng từ các dòng mang những đột biến này cho thấy độ nhạy của thần kinh giảm đối với sự ức chế của permethrin. Hai trong số những đột biến này xảy ra ở các codon Iso1011 và Val1016 trong exon 20 và 21 tương ứng. Một sự chuyển tiếp ở vị trí thứ ba của Iso1011 mã hóa một sự thay thế Met1011 và một sự chuyển đổi ở vị trí thứ hai của Val1016 mã hóa sự thay thế Gly1016. Chúng tôi đã sàng lọc cùng một vùng này trong 1318 con muỗi ở 32 dòng bổ sung; 30 dòng từ khắp nơi ở Mỹ Latinh. Trong khi allele Gly1016 chưa bao giờ được phát hiện ở Mỹ Latinh, chúng tôi phát hiện hai đột biến mới ở cùng những codon này. Một sự chuyển tiếp ở vị trí đầu tiên của codon 1011 mã hóa sự thay thế Val trong khi một sự chuyển tiếp ở vị trí đầu tiên của codon 1016 mã hóa sự thay thế Iso. Chúng tôi đã phát triển các xét nghiệm PCR cho bốn đột biến này có thể đọc trên gel agarose hoặc dưới dạng đường cong nóng chảy. Thí nghiệm chọn lọc, một thí nghiệm với deltamethrin trên một dòng lĩnh vực từ Santiago de Cuba và một thí nghiệm khác với permethrin trên một dòng từ Isla Mujeres, Mexico đã nhanh chóng tăng tần suất của allele Iso1016. Các thử nghiệm sinh học của thế hệ F₃ xuất phát từ các cha mẹ đồng hợp tử Val1016 nhạy cảm với permethrin và các cha mẹ đồng hợp tử kháng permethrin Iso1016 cho thấy rằng Iso1016 phân tách như một allele lặn trong việc gây ra kdr. Phân tích sự phân tách giữa các allele ở các codon 1011 và 1016 trong F₃ cho thấy tỷ lệ tái tổ hợp cao mặc dù hai codon này chỉ cách nhau khoảng ~250 bp intron. Các công cụ và thông tin được trình bày cung cấp một phương tiện để phát hiện sớm và xác định kdr, điều này rất quan trọng cho việc phát triển các chiến lược quản lý kháng thuốc.

Như một bản thảo kèm theo để phát hành bộ gen ong mật, chúng tôi báo cáo toàn bộ trình tự của các gen mã hóa RNA ribosom hạt nhân (18S, 5.8S, 28S và 5S) và ti thể (12S và 16S) (rRNA) và các vùng chuyển tiếp được phiên mã nội bộ và bên ngoài liên quan đến Apis mellifera (Insecta: Hymenoptera: Apocrita). Ngoài ra, chúng tôi dự đoán cấu trúc thứ cấp cho các phân tử rRNA trưởng thành dựa trên phân tích trình tự so sánh với các nhóm động vật chân đốt khác và tham khảo các cấu trúc tinh thể gần đây được công bố của ribosome. Nói chung, các cấu trúc của rRNA ong mật phù hợp với các mô hình rRNA dự đoán trước đó từ các động vật chân đốt khác trong các vùng lõi của rRNA, với ít sự mở rộng bổ sung trong các vùng không bảo tồn. Các căn chỉnh trình tự nhiều lần của chúng tôi được cung cấp trên một vài cơ sở dữ liệu công cộng và cung cấp sự thiết lập sơ bộ của một mô hình cấu trúc toàn cầu cho tất cả các rRNA từ côn trùng. Ngoài ra, chúng tôi cung cấp các đoạn trình tự bảo tồn rìa các cistron rDNA bao gồm các vùng chuyển tiếp được phiên mã bên ngoài (ETS) và một phần của vùng chuyển tiếp liên gen (IGS), bao gồm một số mô típ lặp lại. Cuối cùng, chúng tôi báo cáo sự xuất hiện của quá trình chuyển vị ngược trong rDNA tiểu đơn vị lớn hạt nhân, vì các yếu tố R2 có mặt ở các điểm chèn thông thường tìm thấy trong các động vật chân đốt khác. Thú vị, các yếu tố R1 chức năng thường có trong bộ gen của côn trùng không được phát hiện trong các gen rRNA của ong mật. Sản phẩm của enzym phiên mã ngược của các yếu tố R2 được suy diễn từ các khung đọc mở khả thi của chúng và được căn chỉnh cấu trúc với những yếu tố từ một loài côn trùng Hymenoptera khác, ong bắp cột Nasonia (Pteromalidae). Các đoạn acid amin bảo tồn chia sẻ giữa Apis và Nasonia được minh họa và phục vụ như các vị trí tiềm năng để thiết kế mồi, vì các amplicon mục tiêu trong các yếu tố R2 này có thể phục vụ như các dấu hiệu phát sinh chủng loại mới cho Hymenoptera. Với việc hoàn thành sắp tới của trình tự bộ gen Nasonia, chúng tôi mong đợi báo cáo của chúng tôi cuối cùng sẽ làm sáng tỏ sự tiến hóa của bộ gen Hymenoptera trong các côn trùng bậc cao hơn, đặc biệt là về sự duy trì tương đối của các gen rDNA bảo tồn, các vùng chuyển tiếp biến đổi liên quan và các yếu tố chuyển vị ngược.

Ba dạng nhiễm sắc thể của Anopheles gambiae s.s., được gọi là Bamako, Mopti và Savanna, đã được nghiên cứu bằng các phương pháp xét nghiệm PCR phân tích dựa trên phân tích DNA ribosome liên kết X (rDNA). Nghiên cứu được thực hiện trên một đoạn 1.3 kb chứa một phần của vùng mã hoá 28S và một phần của vùng đệm giữa các gen. Vật liệu được khuếch đại đã bị cắt với mười bốn enzyme hạn chế để phát hiện các đa hình chiều dài đoạn hạn chế (RFLPs). Các enzyme Tru9I và HhaI đã tạo ra các hình thái dải DNA phân biệt Mopti với Savanna và Bamako; hơn nữa, một hình thái 'lai' riêng biệt được nhận diện trong thế hệ con F1 nữ từ cuộc lai giữa Mopti với một trong hai dạng nhiễm sắc thể còn lại. Ý nghĩa chuẩn đoán của xét nghiệm PCR‐RFLP đã được kiểm chứng trên 203 con cái kiểu nhân thể từ các mẫu trường được thu thập tại hai làng ở Mali và một làng ở Burkina Faso. Sự đồng thuận được quan sát giữa phân loại nhiễm sắc thể và phân loại phân tử. Không có hình thái phân tử 'lai' nào được phát hiện ngay cả trong số những cá thể mang kiểu nhân thể hiếm gặp có thể được sinh ra từ giao phối giữa Mopti và Savanna. Kết quả khẳng định các quan sát trước đó chỉ ra sự cản trở dòng gen trong An. gambiae s.s. và khẳng định tình trạng cụ thể của các đơn vị phân loại được đề xuất dựa trên cơ sở di truyền nhiễm sắc thể.

Kênh natri điều chế bởi điện áp là mục tiêu chính của thuốc trừ sâu DDT và pyrethroid, và những đột biến điểm trong vùng miền II của protein kênh đã được liên kết với kiểu hình kháng knockdown (kdr) ở một số loài côn trùng. Chúng tôi báo cáo rằng một trong các đột biến này, một sự thay thế leucine thành phenylalanine trong đoạn màng xuyên qua IIS6, cũng được tìm thấy ở một số dòng rệp kháng thuốc, Myzus persicae. Đột biến này có mặt trong bốn dòng có gen esterase E4 cường độ cao, nhưng không có mặt trong cả hai dòng nhạy cảm và những dòng có gen FE4 cường độ cao. Sự hiện diện suy diễn của kháng loại kdr trong bốn dòng E4 sau đó đã được xác nhận qua các thử nghiệm sinh học cho thấy đây là cơ chế chính của kháng thuốc đối với deltamethrin và DDT, mặc dù cơ chế dựa trên esterase cũng góp phần vào mức độ kháng deltamethrin tổng thể. Đột biến kdr một mình đã mang lại 35 lần kháng lại deltamethrin và điều này đã được nâng cao lên tới 540 lần khi nó có mặt trong bối cảnh esterase cao (E4). Cơ chế esterase (FE4) kém hiệu quả hơn nhiều mà không có đột biến kdr, chỉ mang lại kháng 3-4 lần đối với deltamethrin. Những phát hiện này và sự liên kết mất cân bằng của đột biến kdr trong các dòng sản xuất quá mức esterase E4 có ý nghĩa quan trọng cho sự tiến hóa của kháng thuốc ở côn trùng này và đối với việc sử dụng các loại thuốc xịt pyrethroid trong quản lý quần thể M. persicae tại hiện trường.

Với các trình tự gen của Nasonia vitripennis đã có sẵn, chúng tôi đã cố gắng xác định các protein có mặt trong nọc độc bằng hai phương pháp khác nhau. Đầu tiên, chúng tôi đã tìm kiếm các bản sao của protein nọc độc thông qua một phương pháp sinh tin học, sử dụng các chuỗi axit amin của các protein nọc độc hymenopteran đã biết. Thứ hai, chúng tôi đã thực hiện phân tích protéom của nọc độc N. vitripennis thô được lấy ra từ kho dự trữ nọc độc, triển khai cả hai kỹ thuật sắc ký lỏng hai chiều hỗ trợ phá vỡ laser/máy điện từ thời gian bay (2D‐LC‐MALDI‐TOF) và sắc ký lỏng hai chiều ion hóa phun điện (2D‐LC‐ESI‐FT‐ICR) kết hợp với phân tích khối phổ (MS). Sự kết hợp giữa các nghiên cứu sinh tin học và protéom đã mang lại sự phong phú đáng kinh ngạc về các thành phần nọc độc được xác định. Hơn nữa, một nửa trong số 79 protein được xác định chưa được liên kết với nọc độc của côn trùng: 16 protein cho thấy sự tương đồng chỉ với các protein đã biết từ các mô hoặc bài tiết khác, trong khi 23 protein bổ sung không cho thấy sự tương đồng với bất kỳ protein nào đã biết. Protease serin và các chất ức chế của chúng là nhóm được đại diện nhiều nhất. Mười lăm protein không bài tiết cũng đã được xác định bằng các phương pháp protéom và có thể đại diện cho các yếu tố "dấu vết nọc độc". Nghiên cứu hiện tại đóng góp rất lớn vào sự hiểu biết về sự đa dạng sinh học của nọc độc của các loại ong ký sinh ở cấp độ phân tử.

Chuỗi nucleotide của các vùng xung quanh vùng A + T của Drosophila melanogaster DNA ti thể (mtDNA) đã được xác định. Bao gồm các gen mã hóa cho các RNA vận chuyển cho valine, isoleucine, glutamine và methionine, RNA ribosome nhỏ và các trình tự mã hóa 5' của RNA ribosome lớn và tiểu đơn vị NADH dehydrogenase II. Điều này hoàn thành chuỗi nucleotide của bộ gen ti thể D. melanogaster. mtDNA hình tròn của D. melanogaster khác nhau về kích thước giữa các quần thể khác nhau chủ yếu do sự khác biệt về độ dài trong vùng điều khiển (Fauron & Wolstenholme, 1976; Fauron & Wolstenholme, 1980a, b); vùng mtDNA mà chúng tôi đã giải mã, kết hợp với những vùng đã được giải mã bởi những người khác, tạo ra một bộ gen tổng hợp có chiều dài 19,517 bp so với 16,019 bp của mtDNA D. yakuba. D. melanogaster mtDNA thể hiện sự thiên lệch cực đoan trong thành phần cơ sở; nó bao gồm 82,2% deoxyadenylate và thymidylate residues so với 78,6% trong D. yakuba mtDNA. Tất cả các gen mã hóa trong mtDNA của cả hai loài nằm ở các vị trí và hướng giống nhau. Phân tích sự thay thế nucleotide cho thấy các gen tRNA và rRNA tiến hóa với tốc độ ít hơn một nửa so với các gen mã hóa protein.