Rotavirus là gì? Các công bố khoa học về Rotavirus

Phân đoạn gen rotavirus mã hóa glycoprotein chính lớp vỏ capsid ngoài VP7 đã được khuếch đại trực tiếp từ mẫu phân bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). RNA hai sợi được chiết xuất từ mẫu phân đã được sử dụng làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược, sau đó tiếp diễn trong cùng một hỗn hợp phản ứng với sự khuếch đại, sử dụng polymerase Taq. Nhiều điều kiện khác nhau đã được kiểm tra để tối ưu hóa sản lượng gen được khuếch đại. Nồng độ MgCl2, dimethyl sulfoxide, và RNA khuôn mẫu là các yếu tố quan trọng. Việc lựa chọn cặp mồi cho phép khuếch đại toàn bộ phân đoạn hoặc các phần cụ thể. Bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu kiểu loại có nguồn gốc từ các vùng khác nhau trên gen, chúng tôi đã phát triển một phương pháp định kiểu PCR mà mỗi kiểu huyết thanh virus của người tạo ra một kích thước phân đoạn đặc trưng, dễ nhận biết trong gel agarose. Phương pháp định kiểu PCR đã được áp dụng cho 10 chủng chuẩn rotavirus, bao gồm tất cả 6 kiểu huyết thanh của người đã biết (kiểu huyết thanh 1, 2, 3, 4, 8 và 9), và cho 34 mẫu phân đã được định kiểu huyết thanh trước đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng. Có sự tương quan tuyệt đối giữa các phương pháp sinh học phân tử và huyết thanh học. Ngoài ra, 14 mẫu phân không thể phân định kiểu huyết thanh bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng có thể được phân định kiểu bằng phương pháp PCR. Ngoài ứng dụng cho việc phát hiện và định kiểu rotavirus trực tiếp từ phân, phương pháp PCR cung cấp một phương tiện nhanh chóng và hiệu quả để thu được số lượng lớn cDNA thích hợp cho việc giải trình tự, nhân bản và các nghiên cứu di truyền khác, không cần thiết phải nuôi cấy tế bào và tinh sạch virus.

Năm nhóm gen 4 của rotavirus người (HRV) đã được phân biệt dựa trên việc so sánh trình tự nucleotide và dự đoán chuỗi axit amin, trong đó ít nhất bốn nhóm đại diện cho các loại kháng nguyên VP4 khác biệt. Để xác định từng loại gen 4 và điều tra sự phân bố của chúng trong các mẫu HRV từ bệnh nhân tiêu chảy, chúng tôi đã phát triển một phương pháp phân loại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng thông tin trình tự có sẵn cho bốn loại gen 4 khác nhau. RNA sợi kép của rotavirus (dsRNA) tách từ mẫu phân được sao chép ngược và khuếch đại bằng PCR sử dụng hai primer oligonucleotide tương ứng với các vùng được bảo tồn cao trong tất cả các loại gen 4 đã biết của HRV. Các sản phẩm DNA sợi kép 876 bp sau đó được khuếch đại lại bằng PCR trong sự hiện diện của hỗn hợp chứa một primer dương tính bảo tồn và bốn primer âm tính đặc hiệu cho từng loại (được chọn từ vùng biến đổi mạnh của gen 4), tạo ra các sản phẩm dài 345, 483, 267 và 391 bp tương ứng cho các loại gen 4 là 1, 2, 3 và 4. Phương pháp này xác định reliably các loại gen 4 của 16 mẫu HRV được đặc trưng tốt. Kết quả của chúng tôi đã được xác nhận độc lập cho tất cả 16 chuỗi bằng sao chép ngược và khuếch đại PCR của HRV dsRNA trong sự hiện diện của các cặp primer đặc hiệu cho từng loại khác nhau. Để phân loại trực tiếp gen 4 của HRV trong các mẫu phân, chúng tôi đã phát triển một phương pháp chiết RNA sợi kép của rotavirus từ các mẫu phân bằng cách sử dụng bột thủy tinh. Kết quả của chúng tôi cho thấy phân loại gen 4 sẽ hữu ích trong việc cung cấp sự đặc trưng đầy đủ hơn của các chủng HRV có liên quan đến dịch tễ học hoặc vaccine.

Vắc xin rotavirus an toàn và hiệu quả đang là nhu cầu cấp bách, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Cơ sở kiến thức quan trọng đối với phát triển và triển khai vắc xin là về dịch tễ học của các kiểu huyết thanh/kiểu gen G và P của rotavirus trên toàn thế giới. Phân bố theo thời gian và địa lý của các kiểu G và P rotavirus ở người được xem xét thông qua phân tích tổng cộng 45571 chủng được thu thập toàn cầu từ 124 nghiên cứu báo cáo từ 52 quốc gia trên năm châu lục, công bố trong giai đoạn 1989 đến 2004. Bốn kiểu G phổ biến (G1, G2, G3 và G4) kết hợp với P[8] hoặc P[4] chiếm hơn 88% tổng số chủng phân tích trên toàn thế giới. Ngoài ra, các virus kiểu huyết thanh G9 kết hợp với P[8] hoặc P[6] đã nổi lên là kiểu G quan trọng thứ tư trên toàn cầu với tần suất tương đối 4,1%. Khi phân phối toàn cầu các kiểu G và/hoặc P được chia thành năm lục địa/phân lục địa, nhiều đặc điểm đặc trưng đã nổi lên. Ví dụ, P[8]G1 chiếm hơn 70% các trường hợp nhiễm rotavirus ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Úc, nhưng chỉ khoảng 30% các trường hợp nhiễm ở Nam Mỹ và Châu Á, cùng với 23% ở Châu Phi. Ngoài ra, ở Châu Phi (i) tần suất tương đối của G8 cao ngang với G3 hoặc G4 thường gặp trên toàn cầu, (ii) P[6] chiếm gần một phần ba tổng số các kiểu P xác định được và (iii) 27% các trường hợp nhiễm bệnh liên quan đến các chủng rotavirus mang các kết hợp không bình thường như P[6]G8 hoặc P[4]G8. Hơn nữa, ở Nam Mỹ, virus G5 ít phổ biến dường như tăng mức độ quan trọng dịch tễ học trong số các trẻ em bị tiêu chảy. Những phát hiện như vậy đã (i) khẳng định tầm quan trọng của việc giám sát liên tục các chủng rotavirus một cách chủ động trong nhiều bối cảnh địa lý khác nhau và (ii) cung cấp các cân nhắc quan trọng cho phát triển và triển khai một vắc xin rotavirus hiệu quả (ví dụ, điều chỉnh kiểu P-G theo địa lý trong việc bào chế vắc xin đa giá thế hệ tiếp theo). Bản quyền © 2004 John Wiley & Sons, Ltd.

Phân loại rotavirus nhóm A hiện nay dựa trên các đặc điểm phân tử của hai protein lớp ngoài, VP7 và VP4, và protein lớp giữa, VP6. Do sự tái sắp xếp của tất cả 11 đoạn gene rotavirus đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra sự đa dạng của rotavirus trong tự nhiên, một hệ thống phân loại dựa trên tất cả các đoạn gene rotavirus là cần thiết để xác định các gene nào ảnh hưởng đến giới hạn phạm vi ký chủ, sự nhân lên, và độ độc của rotavirus, cũng như để nghiên cứu dịch tễ học và tiến hóa của rotavirus. Để thiết lập hệ thống phân loại này, các trình tự gene mã hóa cho VP1 đến VP3, VP6, và NSP1 đến NSP5 đã được xác định cho các chủng rotavirus người và động vật thuộc các kiểu gene G và P khác nhau ngoài các dữ liệu sẵn có, và chúng được sử dụng để xác định mối quan hệ phát sinh loài giữa tất cả các gene rotavirus. Dựa trên các phân tích phát sinh loài này, các giá trị cắt giảm sự tương đồng gen thích hợp đã được xác định cho từng gene. Đối với gene VP4, giá trị cắt giảm nucleotide 80% hoàn toàn tương ứng với 27 kiểu gene P đã được thiết lập. Đối với gene VP7, giá trị cắt giảm nucleotide 80% chủ yếu trùng với các kiểu gene G đã thiết lập nhưng đã xác định thêm bốn kiểu gene khác biệt, gồm các chủng rotavirus chuột hoặc chim. Phân tích phát sinh loài của các gene VP1 đến VP3, VP6, và NSP1 đến NSP5 đã cho thấy sự tồn tại của 4, 5, 6, 11, 14, 5, 7, 11 và 6 kiểu gene, tương ứng, dựa trên các giá trị cắt giảm nucleotide lần lượt là 83%, 84%, 81%, 85%, 79%, 85%, 85%, 85% và 91%. Theo dữ liệu này, một danh pháp cải thiện cho các chủng rotavirus được đề xuất. Hệ thống phân loại mới cho phép nhận diện (i) các kiểu gene khác biệt, có thể theo các con đường tiến hóa riêng biệt; (ii) các sự chuyển giao giữa các loài và vô số sự kiện tái sắp xếp; (iii) một số cấu trúc gene cho thấy (a) nguồn gốc chung giữa các chủng rotavirus dạng Wa ở người và lợn và (b) nguồn gốc chung giữa các chủng rotavirus dạng DS-1 ở người và bò. Các liên kết tiến hóa chặt chẽ này giữa rotavirus người và động vật nhấn mạnh nhu cầu giám sát đồng thời rotavirus ở động vật và người.