Khuếch đại và định kiểu axit nucleic của rotavirus từ mẫu phân bằng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase

Phân đoạn gen rotavirus mã hóa glycoprotein chính lớp vỏ capsid ngoài VP7 đã được khuếch đại trực tiếp từ mẫu phân bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). RNA hai sợi được chiết xuất từ mẫu phân đã được sử dụng làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược, sau đó tiếp diễn trong cùng một hỗn hợp phản ứng với sự khuếch đại, sử dụng polymerase Taq. Nhiều điều kiện khác nhau đã được kiểm tra để tối ưu hóa sản lượng gen được khuếch đại. Nồng độ MgCl2, dimethyl sulfoxide, và RNA khuôn mẫu là các yếu tố quan trọng. Việc lựa chọn cặp mồi cho phép khuếch đại toàn bộ phân đoạn hoặc các phần cụ thể. Bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu kiểu loại có nguồn gốc từ các vùng khác nhau trên gen, chúng tôi đã phát triển một phương pháp định kiểu PCR mà mỗi kiểu huyết thanh virus của người tạo ra một kích thước phân đoạn đặc trưng, dễ nhận biết trong gel agarose. Phương pháp định kiểu PCR đã được áp dụng cho 10 chủng chuẩn rotavirus, bao gồm tất cả 6 kiểu huyết thanh của người đã biết (kiểu huyết thanh 1, 2, 3, 4, 8 và 9), và cho 34 mẫu phân đã được định kiểu huyết thanh trước đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng. Có sự tương quan tuyệt đối giữa các phương pháp sinh học phân tử và huyết thanh học. Ngoài ra, 14 mẫu phân không thể phân định kiểu huyết thanh bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme với kháng thể đơn dòng có thể được phân định kiểu bằng phương pháp PCR. Ngoài ứng dụng cho việc phát hiện và định kiểu rotavirus trực tiếp từ phân, phương pháp PCR cung cấp một phương tiện nhanh chóng và hiệu quả để thu được số lượng lớn cDNA thích hợp cho việc giải trình tự, nhân bản và các nghiên cứu di truyền khác, không cần thiết phải nuôi cấy tế bào và tinh sạch virus.