Pyrosequencing là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Pyrosequencing là phương pháp giải trình tự DNA, nhanh chóng dựa trên tín hiệu ánh sáng phát sinh từ phản ứng luciferase trong quá trình tổng hợp mạch mới. Phương pháp sử dụng pyrophosphate phát sinh khi nucleotide gắn vào mạch để tạo ATP và phát quang bằng luciferase, cho phép xác định chính xác trình tự base DNA.

Giới thiệu chung về Pyrosequencing

Pyrosequencing là phương pháp giải trình tự DNA theo thời gian thực dựa trên phát hiện ánh sáng từ phản ứng hóa học khi nucleotide được gắn vào mạch DNA vừa tổng hợp. Phương pháp này được phát triển lần đầu bởi Ronaghi và cộng sự vào cuối thập niên 1990, mở ra kỷ nguyên giải trình tự nhanh, định lượng và định vị các biến thể di truyền nhỏ như SNP hoặc methyl hóa DNA (Nature Methods overview).

Không giống công nghệ Sanger truyền thống dựa trên bắt màu và điện di, pyrosequencing đo tín hiệu quang phát ra khi phản ứng luciferase chuyển hóa ATP thành ánh sáng. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với số lượng nucleotide gắn vào, cho phép xác định trình tự base theo từng chu kỳ nạp dNTP. Độ dài đọc thường giới hạn ở 30–100 base nhưng độ chính xác cao và khả năng phân tích định lượng tốt.

  • Ứng dụng chính: xác định SNP, genotyping, phân tích methyl hóa.
  • Ưu điểm: thời gian thực, không cần gel/quang phổ bắt màu.
  • Hạn chế: độ dài đọc ngắn, chi phí hóa chất cao.

Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý cốt lõi của pyrosequencing dựa trên việc chuyển hóa pyrophosphate (PPi) phát sinh khi DNA polymerase gắn nucleotide mới, thành tín hiệu ánh sáng qua hai bước enzyme liên tiếp. Đầu tiên, ATP sulfurylase xúc tác:

PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO42\mathrm{PPi} + \mathrm{APS} \xrightarrow{\mathrm{ATP\ sulfurylase}} \mathrm{ATP} + \mathrm{SO}_4^{2-}

Tiếp theo, luciferase sử dụng ATP tạo ra ánh sáng với phương trình:

Luciferin+ATP+O2LuciferaseOxyluciferin+AMP+CO2+Light\mathrm{Luciferin} + \mathrm{ATP} + \mathrm{O}_2 \xrightarrow{\mathrm{Luciferase}} \mathrm{Oxyluciferin} + \mathrm{AMP} + \mathrm{CO}_2 + \mathrm{Light}

Cường độ ánh sáng đo được trên máy dò quang học tỷ lệ thuận với lượng ATP tạo thành, tương ứng với số nucleotide gắn. Một enzyme phụ trợ apyrase liên tục phân hủy dNTP dư thừa và ATP để đưa hệ thống về trạng thái chuẩn cho chu kỳ tiếp theo.

Quy trình thực nghiệm cơ bản

Quy trình pyrosequencing gồm các bước chính:

  1. Chuẩn bị mẫu DNA: giải trình tự DNA mẫu, xử lý loại bỏ RNA, định lượng và tinh sạch tới độ tinh khiết cao (A260/A280 ~1.8).
  2. Gắn primer đặc hiệu: thiết kế mồi (primer) sát khu vực mục tiêu, gắn lên hạt bead hoặc bề mặt chip.
  3. Tổng hợp và đọc tín hiệu: tuần tự nạp từng loại dNTP; máy sẽ phát dNTP, ghi nhận tín hiệu ánh sáng, rồi dùng apyrase loại bỏ dư thừa trước khi nạp nucleotide tiếp theo.

Mỗi chu kỳ chỉ đưa vào một loại dNTP (A, T, C hoặc G) để đảm bảo tính định lượng. Dữ liệu thu được dưới dạng biểu đồ cường độ ánh sáng theo mỗi chu kỳ, phần mềm phân tích sẽ xác định chuỗi base tương ứng.

Thiết bị và hóa chất chính

Thiết bị điển hình cho pyrosequencing gồm máy PyroMark hoặc PyroGold (Thermo Fisher), tích hợp buồng phản ứng, hệ thống phát dNTP và đầu đọc quang học. Máy có khả năng chạy 24–96 mẫu đồng thời tùy model (Thermo Fisher PyroMark Q24).

Thành phầnChức năng
DNA polymeraseTổng hợp chuỗi DNA mới
ATP sulfurylaseChuyển PPi thành ATP
LuciferaseChuyển ATP thành ánh sáng
ApyrasePhân hủy dNTP và ATP dư
dNTP mixNucleotide chuẩn cho tổng hợp
APS (adenosine 5′-phosphosulfate)Cơ chất cho ATP sulfurylase

Hóa chất phải đạt độ tinh khiết cao để tránh tín hiệu nhiễu. Chip hoặc bead mang primer yêu cầu xử lý bề mặt chuẩn để gắn DNA mẫu chắc và đồng nhất. Máy tự động hóa hóa trình tự, cho phép thời gian thực và theo dõi mỗi chu kỳ mà không cần tách mẫu thủ công.

Ưu điểm của Pyrosequencing

Pyrosequencing mang lại độ chính xác cao trong xác định trình tự base nhờ tín hiệu ánh sáng tỷ lệ tuyến tính với số nucleotide gắn. Điều này cho phép phân tích định lượng tỉ lệ đột biến hoặc mức độ methyl hóa DNA trong mẫu với giới hạn phát hiện đến 5–10% biến thể (NCBI PMC: Pyrosequencing chemistry).

Phương pháp hoạt động theo thời gian thực, loại bỏ bước điện di hoặc bắt màu, giúp giảm sai số do thao tác thủ công. Kết quả phân tích có thể thu được ngay sau khi hoàn thành các chu kỳ nạp dNTP, rút ngắn thời gian thực nghiệm so với Sanger.

  • Định lượng chính xác SNP và đột biến điểm (even at low allele frequencies).
  • Phân tích methyl hóa với độ nhạy cao, phù hợp nghiên cứu epigenetics.
  • Không cần gel hoặc tách mảnh DNA, giảm nguy cơ nhiễm chéo.

Khả năng tự động hóa cao khi kết hợp với hệ thống chạy mẫu hàng loạt (high-throughput) giúp tăng năng suất và nhất quán kết quả. Thiết kế các bộ kit thương mại của Qiagen và Thermo Fisher hỗ trợ đa dạng dung lượng mẫu, từ 24 đến 96 phản ứng mỗi lần chạy (Qiagen: Pyrosequencing workflow).

Nhược điểm và giới hạn

Mặc dù có nhiều ưu điểm, pyrosequencing vẫn tồn tại một số hạn chế về băng thông đọc và chi phí. Độ dài đọc tối đa thường giới hạn trong khoảng 30–100 base, không đủ cho các đoạn gen lớn hoặc vùng có cấu trúc phức tạp như đoạn dễ gắn kết (repeat region).

Chi phí hóa chất và enzyme cao hơn so với các phương pháp thế hệ mới như Illumina hoặc Nanopore. Hóa chất cần độ tinh khiết đặc biệt, và mỗi chu kỳ nạp nucleotide đòi hỏi enzyme tái lập trạng thái, làm tăng chi phí cho mỗi mẫu phân tích.

  • Độ dài đọc ngắn, không phù hợp giải trình tự de novo hoặc khảo sát biến thể cấu trúc lớn.
  • Phiên bản máy móc hiện tại chưa hỗ trợ multiplexing cao như các nền tảng NGS.
  • Tín hiệu ánh sáng dễ nhiễu nếu nồng độ PPi hoặc ATP dư thừa không được kiểm soát tốt.

Do đó, pyrosequencing thường được sử dụng cho các ứng dụng mục tiêu nhỏ gọn chứ không phải giải trình tự toàn bộ genome. Cần tối ưu hóa bước xử lý mẫu và hiệu chỉnh phần mềm phân tích để giảm sai số nền và cải thiện giới hạn phát hiện (Frontiers in Genetics: Sequencing technologies comparison).

So sánh với các công nghệ giải trình tự khác

So với phương pháp Sanger truyền thống, pyrosequencing nhanh hơn và cho kết quả định lượng tốt hơn, nhưng không thể đọc đoạn dài vượt quá 100 base. Khi so sánh với nền tảng Illumina MiSeq, độ dài đọc của Illumina (150–300 bp) vượt trội hơn, trong khi chi phí trên base thấp hơn nhờ khả năng multiplexing cao.

Nền tảng Nanopore (Oxford Nanopore) có thể đọc dài hàng kilobase nhưng gặp hạn chế về độ chính xác điểm, trong khi pyrosequencing cho độ chính xác cao cho đoạn ngắn. Bảng so sánh sau đây tóm tắt đặc tính cơ bản:

Công nghệĐộ dài đọcĐộ chính xácChi phí/mẫu
Sanger600–1000 bp~99.99%Thấp–Trung bình
Pyrosequencing30–100 bp~99.5% cho mỗi baseTrung bình–Cao
Illumina150–300 bp~99.9%Thấp
Nanopore>10 kb~95–98%Thấp–Trung bình

Việc lựa chọn nền tảng phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu: pyrosequencing phù hợp cho phân tích biến thể nhỏ, methyl hóa, còn NGS thế hệ mới hiệu quả hơn cho quy mô lớn hoặc giải trình tự de novo.

Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Trong sinh học phân tử, pyrosequencing được ứng dụng rộng rãi cho việc genotyping SNP, xác định biến thể điểm và khảo sát methyl hóa tại các vùng promoter hoặc CpG island. Định lượng biểu hiện gen thông qua phân tích cDNA đã được methyl hóa giúp nghiên cứu epigenetic và điều hòa gen (Thermo Fisher PyroMark Q24).

Phương pháp này cũng được dùng để khảo sát tính đa dạng di truyền trong quần thể vi sinh, xác định tần suất alen trong mẫu môi trường hoặc lâm sàng. Khả năng xử lý mẫu hàng loạt và phân tích tự động giúp tăng tốc độ và độ lặp lại của thí nghiệm.

  • Genotyping SNP trong quần thể người, động vật, thực vật.
  • Phân tích methyl hóa DNA để đánh giá thay đổi epigenetic trong bệnh lý.
  • Khảo sát đa dạng vi sinh vật bằng cách giải trình tự gene đích 16S rRNA.

Nhiều bài báo nghiên cứu đã báo cáo sử dụng pyrosequencing để phân tích đột biến ung thư, theo dõi tiến triển bệnh và phản ứng điều trị dựa trên tỷ lệ methyl hóa và đột biến điểm (Nature Methods overview).

Ứng dụng lâm sàng và chẩn đoán

Pyrosequencing đã được chứng nhận dùng trong lâm sàng để chẩn đoán đột biến liên quan ung thư (EGFR, KRAS), theo dõi kháng thuốc vi khuẩn (MTB, MRSA) và kiểm tra mức độ methyl hóa promoter gen tumor suppressor. Độ chính xác cao giúp phát hiện biến thể với tỉ lệ thấp, quan trọng trong chẩn đoán sớm (NCBI PMC: Pyrosequencing chemistry).

Trong xét nghiệm y học, tiết kiệm thời gian và mẫu bệnh phẩm là ưu thế khi chỉ cần vài chục ngàn bản sao DNA. Kết quả thường cho trong 4–6 giờ, nhanh hơn so với phương pháp truyền thống và một số NGS cơ bản.

  • Chẩn đoán ung thư dựa trên đột biến điểm và methyl hóa gen.
  • Phát hiện kháng thuốc vi khuẩn trong bệnh phẩm lâm sàng.
  • Đánh giá nguy cơ di truyền cho các bệnh hiếm gặp.

Thách thức và hướng phát triển tương lai

Thách thức lớn nhất hiện nay là mở rộng độ dài đọc và giảm chi phí hoạt động. Nghiên cứu phát triển enzyme và hóa chất mới nhằm tăng hiệu suất tín hiệu và giảm nhiễu đã đang được tiến hành trong các phòng thí nghiệm hàng đầu.

Hướng phát triển có thể bao gồm tích hợp vi mạch microfluidics để giảm dung tích phản ứng, cải thiện multiplexing đồng thời và kết hợp trí tuệ nhân tạo để giải mã tín hiệu nhanh, chính xác hơn. Meta-vật liệu quang học cũng được khảo sát nhằm khuếch đại ánh sáng phát ra, tăng độ nhạy.

  1. Tối ưu enzyme và chất nền để mở rộng độ dài đọc lên 200–300 bp.
  2. Ứng dụng microfluidics và chip lab-on-a-chip cho chạy mẫu tự động, tiết kiệm hóa chất.
  3. Áp dụng AI để phân tích tín hiệu bước sóng, dự đoán trình tự chính xác trong môi trường nhiễu.

Tài liệu tham khảo

Các bài báo, nghiên cứu, công bố khoa học về chủ đề pyrosequencing:

Phân Loại Bayesian Điện Biên Để Gán Nhanh Trình Tự rRNA Vào Hệ Thống Phân Loại Vi Khuẩn Mới Dịch bởi AI
Applied and Environmental Microbiology - Tập 73 Số 16 - Trang 5261-5267 - 2007
TÓM TẮT Dự án Cơ Sở Dữ Liệu Ribosome (RDP) với bộ phân loại Bayesian đơn giản có thể nhanh chóng và chính xác phân loại các trình tự 16S rRNA của vi khuẩn vào hệ thống phân loại cấp cao hơn mới được đề xuất trong Bản phác thảo phân loại vi khuẩn của Bergey (Ấn bản thứ 2, phát hành 5.0, Springer-Verlag, New York, ...... hiện toàn bộ
#Bộ phân loại RDP #rRNA 16S #phân loại vi khuẩn #biến V2 và V4 #pyrosequencing #so sánh cộng đồng vi sinh vật #biểu hiện khác biệt giữa các mẫu.
A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses
ISME Journal - Tập 3 Số 4 - Trang 442-453 - 2009
Abstract Acidobacteria are ubiquitous and abundant members of soil bacterial communities. However, an ecological understanding of this important phylum has remained elusive because its members have been difficult to culture and few molecular investigations have focused exclusively on this group. We generated an unprecedented number of acidobacterial ...... hiện toàn bộ
Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data
ISME Journal - Tập 4 Số 1 - Trang 17-27 - 2010
Abstract Next-generation sequencing techniques, and PhyloChip, have made simultaneous phylogenetic analyses of hundreds of microbial communities possible. Insight into community structure has been limited by the inability to integrate and visualize such vast datasets. Fast UniFrac overcomes these issues, allowing integration of larger numbers of sequ...... hiện toàn bộ
454 Pyrosequencing reveals bacterial diversity of activated sludge from 14 sewage treatment plants
ISME Journal - Tập 6 Số 6 - Trang 1137-1147 - 2012
Abstract Activated sludge (AS) contains highly complex microbial communities. In this study, PCR-based 454 pyrosequencing was applied to investigate the bacterial communities of AS samples from 14 sewage treatment plants of Asia (mainland China, Hong Kong, and Singapore), and North America (Canada and the United States). A total of 259 K effective se...... hiện toàn bộ
Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data
Nature Methods - Tập 6 Số 9 - Trang 639-641 - 2009
Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing
ISME Journal - Tập 6 Số 6 - Trang 1176-1185 - 2012
Abstract Periodontitis has a polymicrobial etiology within the framework of a complex microbial ecosystem. With advances in sequencing technologies, comprehensive studies to elucidate bacterial community differences have recently become possible. We used 454 sequencing of 16S rRNA genes to compare subgingival bacterial communities from 29 periodontal...... hiện toàn bộ
454 pyrosequencing analyses of bacterial and archaeal richness in 21 full-scale biogas digesters
FEMS Microbiology Ecology - Tập 85 Số 3 - Trang 612-626 - 2013
Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults
SAGE Publications - Tập 87 Số 11 - Trang 1016-1020 - 2008
A good definition of commensal microflora and an understanding of its relation to health are essential in preventing and combating disease. We hypothesized that the species richness of human oral microflora is underestimated. Saliva and supragingival plaque were sampled from 71 and 98 healthy adults, respectively. Amplicons from the V6 hypervariable region of the small-subunit ribosomal R...... hiện toàn bộ
New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis
Genes and Development - Tập 21 Số 5 - Trang 601-614 - 2007
Acinetobacter baumannii has emerged as an important and problematic human pathogen as it is the causative agent of several types of infections including pneumonia, meningitis, septicemia, and urinary tract infections. We explored the pathogenic content of this harmful pathogen using a combination of DNA sequencing and insertional mutagenesis. The genome of this o...... hiện toàn bộ
Tổng số: 494   
  • 1
  • 2
  • 3
  • 4
  • 5
  • 6
  • 10