Protoplasts là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa và bản chất của protoplasts

Protoplast là tế bào thực vật, nấm hoặc vi khuẩn đã được loại bỏ hoàn toàn thành tế bào thông qua xử lý enzym hoặc cơ học, để lại phần còn lại là màng sinh chất cùng các thành phần nội bào như nhân, bào quan, và chất nguyên sinh. Việc loại bỏ thành tế bào tạo điều kiện cho các nghiên cứu sinh học tế bào, biến đổi gen và biểu hiện protein trong môi trường được kiểm soát tốt hơn.

Trong sinh học thực vật, protoplast thường được tạo ra từ mô sống, chẳng hạn như lá, rễ hoặc tế bào nuôi cấy, thông qua xử lý bằng hỗn hợp enzyme như cellulase, hemicellulase và pectinase để phá vỡ thành cellulose và pectin. Sau quá trình xử lý, phần còn lại là một đơn vị tế bào trần vẫn còn sống và có thể hoạt động sinh lý bình thường nếu được nuôi dưỡng trong môi trường thích hợp.

Protoplast được xem là nền tảng quan trọng trong nhiều nghiên cứu cơ bản và ứng dụng, bao gồm nghiên cứu tín hiệu nội bào, tương tác gen, biểu hiện protein tái tổ hợp, tái sinh cây và tạo giống lai soma thông qua dung hợp tế bào. Khả năng kiểm soát môi trường nuôi và can thiệp vật liệu di truyền khiến chúng trở thành hệ thống sinh học lý tưởng cho nhiều công nghệ sinh học hiện đại.

Phân biệt protoplasts với các dạng tế bào khác

Điểm khác biệt lớn nhất giữa protoplast và tế bào thông thường là sự vắng mặt của thành tế bào. Điều này khiến protoplast có hình cầu đặc trưng do không còn lực đỡ cơ học từ thành tế bào và dễ bị thay đổi hình dạng dưới ảnh hưởng của lực thẩm thấu hoặc cơ học. Khả năng tiếp nhận vật chất ngoại lai như DNA, RNA hoặc protein cũng tăng lên đáng kể khi không có rào cản thành tế bào.

Do mất thành tế bào, protoplast rất nhạy với biến đổi áp suất thẩm thấu. Chúng phải được duy trì trong dung dịch đẳng trương, thường chứa mannitol, sorbitol hoặc sucrose với nồng độ thích hợp (0.4–0.6 M), nhằm giữ ổn định thể tích và tránh vỡ tế bào. Việc chọn loại và nồng độ chất điều áp phụ thuộc vào loài cây, loại mô và mục đích sử dụng.

Bảng dưới đây tóm tắt một số điểm khác biệt chính giữa protoplast và tế bào có thành:

Tiêu chí	Tế bào nguyên vẹn	Protoplast
Có thành tế bào	Có	Không
Hình dạng	Ổn định, phụ thuộc cấu trúc thành	Dễ thay đổi, thường là hình cầu
Độ nhạy áp suất thẩm thấu	Thấp	Cao
Khả năng biến nạp	Hạn chế	Cao

Quy trình tách chiết protoplast

Quy trình tạo protoplast bắt đầu từ việc chọn mô sống phù hợp, thường là lá non hoặc mô nuôi cấy tế bào. Mẫu mô được cắt nhỏ và xử lý trong dung dịch chứa enzyme thủy phân thành tế bào, trong điều kiện tối và nhiệt độ khoảng 25–28°C để tăng hiệu quả phân giải thành.

Sau khoảng 3–6 giờ (tùy loài), hỗn hợp được lọc qua lưới mịn để loại bỏ mảnh mô chưa tiêu hóa. Dịch lọc chứa protoplast được ly tâm nhẹ trong môi trường đẳng trương, thường là dung dịch mannitol 0.5 M, nhằm thu lấy lớp tế bào hình cầu nổi phía trên.

Các bước cơ bản của quy trình bao gồm:

1. Chuẩn bị mô thực vật (lá, mô sẹo, tế bào treo)
2. Ngâm trong enzyme (cellulase, macerozyme) với chất ổn định pH và áp suất
3. Lọc và ly tâm để thu protoplast
4. Rửa sạch và đánh giá độ sống bằng thuốc nhuộm như fluorescein diacetate (FDA)

Chất lượng và số lượng protoplast thu được phụ thuộc vào loại mô, nguồn gốc loài, nồng độ enzyme, thời gian tiêu hóa và nhiệt độ. Một số loài như Nicotiana tabacum (thuốc lá), Arabidopsis thaliana, và Oryza sativa (lúa) được nghiên cứu nhiều do khả năng sinh protoplast cao và dễ thao tác.

Ứng dụng trong công nghệ di truyền

Protoplast là công cụ trung tâm trong nhiều kỹ thuật biến đổi di truyền nhờ vào khả năng tiếp nhận vật liệu di truyền dễ dàng khi thiếu lớp thành cứng. Trong điều kiện tối ưu, protoplast có thể được biến nạp với plasmid mang gen mục tiêu thông qua các kỹ thuật như điện biến nạp (electroporation) hoặc dùng polyethylen glycol (PEG).

Biến nạp gen vào protoplast có thể là bước đầu trong việc tạo cây biến đổi gen, hoặc dùng cho các phân tích biểu hiện tạm thời để nghiên cứu chức năng gen, phân tích promoter, hoặc định vị protein huỳnh quang. Sự tiện lợi này làm cho protoplast trở thành mô hình lý tưởng trong sinh học phân tử thực vật hiện đại.

Các kỹ thuật thường sử dụng gồm:

• Electroporation: tạo lỗ nhỏ trong màng bằng xung điện ngắn
• PEG-mediated transformation: tạo điều kiện hợp nhất màng với vật liệu DNA ngoại lai
• Microinjection: đưa trực tiếp DNA vào tế bào bằng kim siêu nhỏ (ít phổ biến hơn)

Protoplast biến nạp được ủ từ 12–24 giờ trong môi trường nuôi dưỡng, sau đó đánh giá mức độ biểu hiện gen thông qua phân tích huỳnh quang, RT-qPCR hoặc western blot.

Tái sinh cây từ protoplast

Một trong những mục tiêu quan trọng trong việc sử dụng protoplast là khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh, đặc biệt sau khi thực hiện các thao tác biến nạp hoặc dung hợp. Tuy nhiên, quá trình tái sinh này không dễ dàng và phụ thuộc chặt chẽ vào giống loài, nguồn mô, thành phần môi trường nuôi cấy và các điều kiện cảm ứng sinh trưởng.

Sau khi protoplast được biến nạp hoặc xử lý, chúng được chuyển vào môi trường nuôi cấy lỏng hoặc bán rắn chứa hormone sinh trưởng như auxin (2,4-D) và cytokinin (kinetin, BAP). Môi trường này giúp cảm ứng hình thành vách tế bào mới, sau đó các protoplast sẽ phân chia tạo thành tập hợp tế bào gọi là thể callus. Từ callus, qua điều chỉnh hormone và môi trường, cây có thể được tái sinh thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis) hoặc phôi sinh soma (somatic embryogenesis).

Bảng dưới đây minh họa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh từ protoplast:

Yếu tố	Ảnh hưởng	Gợi ý tối ưu
Giống loài	Quyết định khả năng tái sinh	Nicotiana, Arabidopsis, Petunia dễ tái sinh
Nguồn mô	Ảnh hưởng khả năng phân chia	Lá non hoặc tế bào callus trẻ
Thành phần môi trường	Điều phối quá trình phát sinh cơ quan	MS hoặc N6 với auxin và cytokinin hợp lý
Điều kiện nuôi cấy	Ảnh hưởng khả năng sống	Nhiệt độ 24–28°C, ánh sáng mờ, pH ~5.8

Không phải tất cả các loài thực vật đều có thể tái sinh hiệu quả từ protoplast. Do đó, kỹ thuật này thường được ưu tiên cho các giống cây mô hình hoặc các dòng có khả năng tái sinh đã được tối ưu hóa từ trước.

Protoplast fusion (dung hợp protoplast)

Protoplast từ hai nguồn tế bào khác nhau có thể được dung hợp để tạo ra dòng lai soma (somatic hybrid), một kỹ thuật giúp lai tạo giữa các loài không tương thích về mặt sinh sản hữu tính. Dung hợp có thể xảy ra tự phát (spontaneous fusion) hoặc được thúc đẩy bằng các phương pháp nhân tạo như xử lý bằng PEG hoặc áp dụng xung điện (electrofusion).

Quá trình dung hợp thường bao gồm các giai đoạn: tiếp xúc protoplast, kết dính màng sinh chất, hòa màng và tái tổ chức nhân. Sản phẩm dung hợp có thể chứa bộ gene từ cả hai dòng bố mẹ (tế bào lai) hoặc một phần của chúng (tế bào đồng thể nhân).

Ứng dụng nổi bật bao gồm:

• Lai giữa Solanum tuberosum (khoai tây) và Lycopersicon esculentum (cà chua) tạo cây lai "pomato"
• Dung hợp protoplast giữa cây kháng bệnh với cây cho năng suất cao để kết hợp ưu điểm
• Sản xuất cybrids (cytoplasmic hybrids) để nghiên cứu tính trạng liên quan đến ty thể hoặc lục lạp

Dung hợp protoplast còn đóng vai trò trong nghiên cứu di truyền tế bào và phân tích dòng tế bào dị bội.

Ứng dụng trong phân tích chức năng gen và biểu hiện protein

Hệ thống protoplast là công cụ mạnh để nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời (transient expression), một kỹ thuật cho phép đánh giá nhanh hoạt động của promoter, chức năng gen hoặc vị trí nội bào của protein. Do protoplast không có thành tế bào, vector plasmid hoặc RNA có thể được đưa vào dễ dàng và biểu hiện trong thời gian ngắn từ 12–48 giờ.

Các phân tích thường thực hiện bao gồm:

• Biểu hiện protein huỳnh quang (GFP, RFP) để định vị dưới kính hiển vi huỳnh quang
• Phân tích hoạt động promoter thông qua reporter gene như LUC hoặc GUS
• Nghiên cứu tương tác protein bằng kỹ thuật FRET hoặc BiFC
• Phản ứng tín hiệu sinh học sau xử lý hormone, abiotic stress hoặc nhiễm bệnh

Loài được sử dụng phổ biến là Arabidopsis thaliana, do hệ gene đã được giải mã đầy đủ và dễ chuẩn hóa quy trình biến nạp protoplast.

Những thách thức và giới hạn kỹ thuật

Dù nhiều ưu điểm, việc sử dụng protoplast cũng đối mặt với một số thách thức lớn. Tế bào rất nhạy cảm với áp suất thẩm thấu và môi trường nuôi, nên dễ bị mất khả năng sống hoặc không chia được. Quá trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast đòi hỏi kiểm soát chặt chẽ hormone và điều kiện cấy, đặc biệt ở các loài cây khó tính.

Không phải loài nào cũng có hệ thống tái sinh hiệu quả, khiến việc ứng dụng kỹ thuật này bị giới hạn trong một số nhóm cây mô hình hoặc cây trồng kinh tế quan trọng đã được nghiên cứu nhiều. Thêm vào đó, biểu hiện gen trong protoplast là tạm thời, nên không thể thay thế hoàn toàn cây biến đổi gen ổn định trong nghiên cứu chức năng dài hạn.

Độ chính xác khi giải thích các tương tác phân tử từ hệ thống protoplast cũng cần được xác minh bằng nhiều kỹ thuật độc lập, do điều kiện nuôi tế bào không phản ánh hoàn toàn môi trường in planta.

Xu hướng ứng dụng mới

Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, protoplast đang được tích hợp vào các nền tảng chỉnh sửa genome hiện đại như CRISPR/Cas9, đặc biệt trong các loài cây khó biến nạp bằng vi khuẩn Agrobacterium. Việc đưa ribonucleoprotein (RNP) hoặc vector CRISPR vào protoplast giúp đạt hiệu quả chỉnh sửa cao mà không để lại dấu vết di truyền (transgene-free editing).

Hệ thống protoplast còn được kết hợp với microfluidics để sàng lọc tế bào biểu hiện cao, hoặc gắn cảm biến sinh học để đo tín hiệu nội bào theo thời gian thực. Các công nghệ cao này mở ra tiềm năng áp dụng protoplast không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn trong nông nghiệp chính xác và phát triển giống cây thế hệ mới.

Tài liệu tham khảo

1. Sheen J. (2001). Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. DOI:10.1104/pp.125.2.702
2. Yoo SD, Cho YH, Sheen J. (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. DOI:10.1038/nprot.2007.199
3. Davey MR et al. (2005). Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnology Advances. DOI:10.1016/j.biotechadv.2005.03.001
4. Protocols.io – Protoplast Isolation. https://www.protocols.io/
5. Fujikawa Y, Kato N. (2007). Split luciferase complementation assay to study protein–protein interactions in Arabidopsis protoplasts. Plant Journal. DOI:10.1111/j.1365-313X.2007.03278.x
6. Lin CS et al. (2018). Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 genome editing in plants. Plant Cell Reports. DOI:10.1007/s00299-018-2323-z