Fluorescein là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa và cấu trúc hóa học

Fluorescein là phân tử huỳnh quang thuộc họ xanthene, có công thức hóa học C20H12O5. Phân tử này gồm hai vòng benzene gắn vào nhân xanthene trung tâm, tạo nên hệ liên hợp π mở rộng giúp hấp thụ và phát xạ ánh sáng trong vùng bước sóng xanh lục đến vàng lục. Fluorescein thường tồn tại dưới dạng muối natri hoặc kali để tăng tính tan trong nước và ổn định trong điều kiện sinh học.

Cấu trúc phân tử thể hiện một nhân xanthene gồm hai vòng benzofuran liên kết qua một nguyên tử oxy, hai nhóm hydroxyl ở vị trí 3’ và 6’ trên vòng aromatic, cùng một nhóm cỡn carboxyl (–COOH) tại vị trí 2. Sự phân bố electron pi trên toàn cấu trúc này tạo ra dải hấp thụ và phát xạ hẹp, giúp tách tín hiệu rõ ràng khi sử dụng làm dấu huỳnh quang.

Phân tử fluorescein có dạng đa hình phụ thuộc pH: ở pH thấp (<5), dạng lactone nội phân tử chiếm ưu thế, yếu huỳnh quang; khi pH tăng lên >6, nhóm carboxyl khử proton cho dạng carboxylate mang điện tích âm, độ ổn định quang tăng mạnh và đạt cực đại ở pH ~8.5.

Tính chất vật lý – hóa học

Fluorescein xuất hiện dưới dạng bột tinh thể màu cam vàng, với nhiệt độ nóng chảy khoảng 300 °C (phân hủy). Nó hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như ethanol, DMSO và dimethylformamide, trong khi tan kém trong nước nếu ở dạng không muối. Độ tan trong nước của muối natri fluorescein đạt khoảng 50 g/L ở 25 °C.

Giá trị pKa của fluorescein (nhóm –COOH) vào khoảng 6.4, điều này đồng nghĩa với sự chuyển đổi giữa dạng proton hóa và khử proton khi pH dao động quanh ngưỡng này. Độ bền quang (photostability) cao giúp fluorescein chịu được chiếu sáng trong thời gian dài mà tín hiệu huỳnh quang không giảm đáng kể.

Các tính chất này làm cho fluorescein trở thành chất chỉ thị pH, chất đánh dấu sinh học và ứng dụng rộng rãi trong y sinh và phân tích công nghiệp.

Quang học – phổ hấp thụ và phát xạ

Fluorescein hấp thụ mạnh ánh sáng xanh lam với đỉnh hấp thụ quanh 494 nm và phát xạ ở vùng xanh lục với đỉnh phát xạ khoảng 521 nm trong môi trường đệm pH ~8. Độ giãn phổ hẹp (full width at half maximum, FWHM) chỉ khoảng 25–30 nm cho cả phổ hấp thụ và phát xạ, giúp tránh chồng lấn tín hiệu khi đồng dùng nhiều dấu huỳnh quang.

Hiệu suất lượng tử (quantum yield) của fluorescein ở điều kiện tối ưu có thể đạt tới 0.9–0.95, nghĩa là hầu hết photon kích thích được chuyển thành photon phát xạ. Độ dài sống trạng thái kích thích (fluorescence lifetime) vào khoảng 4 ns, phù hợp cho các ứng dụng đo thời gian sống (FLIM).

• Đỉnh hấp thụ: ~494 nm
• Đỉnh phát xạ: ~521 nm
• Quantum yield: ~0.9
• Lifetime: ~4 ns

Cơ chế phát huỳnh quang

Khi photon có năng lượng phù hợp (hầu hết dùng laser 488 nm hoặc đèn LED xanh lam) hấp thụ bởi phân tử fluorescein, electron trong trạng thái cơ bản (S0) được kích lên trạng thái kích thích S1. Từ đây, phân tử có thể trở về S0 qua phát xạ photon với bước sóng dài hơn (xuống mức phát xạ).

Trong quá trình này, phần năng lượng dư thừa thường được tỏa ra qua tắt không bức xạ (non-radiative decay) như dao động phân tử hoặc tương tác với phân tử dung môi. Tỷ lệ giữa năng lượng phát xạ và tổng năng lượng kích thích quyết định hiệu suất lượng tử.

• Kích thích: photon 488 nm → S1
• Tắt không bức xạ: dao động nội phần tử hoặc tương tác môi trường
• Phát xạ: photon ~521 nm (fluorescence)

Sự kết hợp giữa cấu trúc liên hợp pi và khả năng tắt không bức xạ thấp làm fluorescein trở thành một trong những chất huỳnh quang hiệu quả nhất trong nghiên cứu sinh học và phân tích quang học.

Ứng dụng trong sinh học và y học

Fluorescein là dấu huỳnh quang tiêu chuẩn trong kính hiển vi laser quét và kính hiển vi huỳnh quang, giúp quan sát cấu trúc tế bào với độ tương phản cao. Phương pháp đánh dấu trực tiếp bằng fluorescein isothiocyanate (FITC) cho phép gắn fluorophore lên phân tử protein, kháng thể hoặc acid nucleic, phục vụ định vị bề mặt tế bào và phân tích dòng tế bào (flow cytometry).

Trong nhãn khoa, kỹ thuật fluorescein angiography sử dụng dung dịch fluorescein natri tiêm tĩnh mạch để quan sát lưu thông mạch máu võng mạc. Dung dịch màu huỳnh quang này đi qua các mao mạch võng mạc và đáy mắt, cho phép phát hiện rò rỉ mạch, tắc nghẽn hoặc tăng sinh mạch bất thường trong bệnh đái tháo đường và thoái hóa điểm vàng tuổi già.

Ứng dụng live-cell imaging với fluorescein giúp ghi lại động học protein trong tế bào sống mà không làm tổn hại chức năng sinh học. Các kỹ thuật FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) và FRET (Förster Resonance Energy Transfer) dựa vào tính bền huỳnh quang và thời gian sống của fluorescein để đo khoảng cách nano và tương tác phân tử trong môi trường nội bào.

Ứng dụng trong công nghiệp và phân tích

Trong phân tích môi trường, fluorescein được dùng làm chất chỉ thị pH nhờ thay đổi cường độ huỳnh quang và màu sắc khi pH thay đổi. Dải pH hữu ích thường nằm trong khoảng 6–9, phù hợp cho các quy trình xử lý nước thải và giám sát nước uống.

HPLC và sắc ký mao quản (CE) sử dụng fluorescein như chất chỉ thị nội tuyến (post-column derivatization) hoặc nội chuẩn (internal standard) để định lượng hợp chất có nhóm amin hoặc hydroxyl. Độ nhạy có thể đạt ngưỡng picogram nhờ hiệu suất lượng tử cao của fluorescein.

• Kiểm tra rò rỉ đường ống và van bằng giọt fluorescein: phát hiện khe hở qua tín hiệu huỳnh quang.
• Cảm biến dòng chảy microfluidics: theo dõi vận tốc và phân bố mẫu dung dịch trong kênh vi lưu.
• Phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu và kim loại nặng: fluorescein kết hợp với aptamer hoặc ionophore.

Trong công nghiệp giấy và dệt nhuộm, fluorescein được dùng để kiểm tra đồng đều mực in và độ thấm màu. Dung dịch fluorescein phun lên bề mặt giấy hoặc vải cho phép phát hiện khuyết tật bằng máy quét huỳnh quang tự động.

Tổng hợp và biến đổi hóa học

Quy trình tổng hợp fluorescein truyền thống bắt đầu từ phthalic anhydride và resorcinol trong môi trường axit mạnh (H2SO4 hoặc HCl đậm đặc), tạo thành nhân xanthene và vòng lactone. Kiểm soát nhiệt độ 120–150 °C và thời gian phản ứng 4–6 giờ đảm bảo thu được sản phẩm cơ bản với độ tinh khiết cao.

Biến đổi hóa học dẫn đến các dẫn xuất như fluorescein isothiocyanate (FITC) qua phản ứng giữa nhóm –NH2 và –N=C=S, giúp gắn trực tiếp lên lysine của protein. Các dẫn xuất khác như NHS-ester fluorescein tạo kết nối mạnh mẽ với nhóm –COOH, thích hợp cho đánh dấu acid nucleic.

Phương pháp xử lý sau tổng hợp bao gồm tinh chế qua sắc ký cột silica gel hoặc sắc ký lỏng ngược pha (reverse-phase HPLC). Kỹ thuật phân tích xác định cấu trúc gồm phổ NMR 1H, 13C và khối phổ (MS).

Phương pháp đánh giá và định lượng

Phổ hấp thụ và phát xạ của fluorescein được đo bằng UV-Vis spectrophotometer và fluorometer với đèn xenon hoặc laser excitation 488 nm. Thử nghiệm hiệu chuẩn thường xây dựng đường chuẩn bằng loang loạt nồng độ fluorescein trong đệm PBS, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

Phương pháp nội chuẩn (internal standard) sử dụng Rhodamine B hoặc rhodamine 6G để bù đắp dao động nguồn sáng và biến động quang học. Để đánh giá độ ổn định, mẫu fluorescein được chiếu sáng liên tục trong 30–60 phút, đo cường độ huỳnh quang theo thời gian để tính photobleaching rate.

• Xây dựng đường chuẩn: nồng độ 1 nM – 10 µM trong đệm pH 8.
• Đo LOD/LOQ: tính toán theo phương pháp 3σ hoặc 10σ của tín hiệu nền.
• Phân tích quang phổ: FWHM và quantum yield đánh giá tính chọn lọc.

An toàn và độc tính

Fluorescein natri có LD50 ở chuột đường uống ≈3420 mg/kg, cho thấy độc tính cấp thấp. Tuy nhiên, muối fluorescein có thể gây kích ứng da, mắt và đường hô hấp khi tiếp xúc trực tiếp. Thiết bị bảo hộ cá nhân (PPE) gồm găng tay, áo lab, kính bảo hộ là bắt buộc khi thao tác.

Thải bỏ fluorescein cần tuân thủ quy định chất thải hóa học nguy hại: thu gom riêng, không đổ trực tiếp vào cống. Phương pháp xử lý có thể bao gồm trung hòa pH, kết tủa với kim loại nặng hoặc đốt oxy hóa trước khi thải.

Môi trường nước có thể chịu ảnh hưởng nhẹ do fluorescein không phân hủy nhanh; một số nghiên cứu khuyến nghị tái sinh dung dịch và hạn chế xả thải trực tiếp. Các hướng dẫn an toàn chi tiết có tại Sigma-Aldrich MSDS.

Xu hướng nghiên cứu và phát triển

Nhiều nghiên cứu hướng đến thiết kế fluorescein thế hệ mới với độ dài phát xạ dịch chuyển sang bước sóng đỏ (red-shifted) để giảm tự phát huỳnh quang nền của mô sinh học. Các khung xanthene biến đổi vòng aromatic giúp mở rộng phổ phát xạ đến 600–650 nm.

Công nghệ nano kết hợp fluorescein trên hạt silica hoặc liposome tạo cảm biến huỳnh quang thông minh, phản ứng nhanh với ion hoặc phân tử mục tiêu. Microfluidics tích hợp cảm biến fluorescein cho phép thử nghiệm point-of-care (POC) và phát hiện nhanh nồng độ glucose, lactate trong mẫu máu.

Phương pháp siêu độ phân giải như STED và PALM dùng fluorescein và biến thể của nó để đạt độ phân giải <50 nm, phục vụ nghiên cứu cấu trúc protein màng và tương tác tế bào ở mức độ phân tử.

Tài liệu tham khảo

1. PubChem, “Fluorescein,” NIH. pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Fluorescein
2. Adams SR & Tsien RY., “Fluorescent probes for biological activity,” Methods Enzymol., 1993. doi.org/10.1016/0076-6879(93)07013-B
3. Sigma-Aldrich, “Fluorescein, sodium salt,” MSDS. sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/330000
4. Haugland RP., “Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,” 10th ed., 2005.
5. Boens N. et al., “Fluorescent indicators for intracellular pH,” Anal. Biochem., 2007. doi.org/10.1016/j.ab.2007.04.005
6. Lavis LD & Raines RT., “Bright ideas for chemical biology,” ACS Chem. Biol., 2008. doi.org/10.1021/cb800258j
7. Chung K. et al., “Red-shifted xanthene dyes for deep-tissue imaging,” J. Am. Chem. Soc., 2012. doi.org/10.1021/ja301238u