Yeast

Chúng tôi đã xây dựng và kiểm nghiệm một mô-đun kháng sinh ưu thế, để lựa chọn các biến đổi gen của S. cerevisiae, hoàn toàn bao gồm DNA dị loại. Mô-đun kanMX này chứa khung đọc mở kanr đã biết của yếu tố di chuyển Tn903 từ E. coli kết hợp với các chuỗi điều khiển phiên mã và dịch mã của gene TEF từ nấm sợi Ashbya gossypii. Mô-đun lai này cho phép lựa chọn hiệu quả các biến đổi gen kháng lại geneticin (G418). Chúng tôi cũng đã xây dựng một mô-đun báo cáo lacZMT trong đó khung đọc mở của gene E. coli lacZ (thiếu 9 mã đầu tiên) được liên kết tại đầu 3′ với đoạn kết thúc S. cerevisiae ADH1. Mô-đun kanMX và mô-đun lacZMT, hoặc cả hai mô-đun cùng nhau, đã được nhân bản vào trung tâm của một chuỗi nhân bản đa dạng mới gồm 18 vị trí hạn chế duy nhất được bao bọc bởi các vị trí Not I. Sử dụng mô-đun kép cho việc xây dựng các sự thay thế trong khung của gene, chỉ cần một thí nghiệm biến đổi để kiểm nghiệm hoạt động của bộ khởi động và tìm kiếm các kiểu hình do việc bất hoạt gene này gây ra. Để cho phép việc sử dụng lặp lại sự lựa chọn G418, một số mô-đun kanMX được viền bằng các nhặp lại trực tiếp dài 470 bp, thúc đẩy việc loại ra in vivo với tần số từ 10–3 đến 10–4. Mô-đun kanMX dài 1,4 kb cũng đã được chứng minh là rất hữu ích cho các sự gián đoạn gene dựa trên PCR. Trong một thí nghiệm mà sự gián đoạn gene đã được thực hiện với các phân tử DNA mang theo các chuỗi kết thúc được thêm vào từ PCR chỉ có 35 baz đôi tương đồng với từng vị trí mục tiêu, tất cả mười hai thuộc địa kháng geneticin được kiểm tra đều mang mô-đun kanMX tích hợp đúng."

The complete sequence of a cytochrome c gene from Kluyveromyces lactis including its upstream region is reported. Sequence of the translated open reading frame is discussed in terms of cytochrome c structural requirements. Putative regulatory signals in the upstream region are described and compared with reported sequences which modulate the expression of respiratory‐related yeast genes.

The above paper (Yeast 9:, 289–293, 1993) erroneously presented a non‐updated sequence due to data‐transmission errors. The corrected sequence is 4939 bp in length and has been deposited in the EMBL Data Library under the accession number X71329. Consequently the amino acid sequences of YBR 12.03 and YBR 12.05 changed.

Four structural genes encoding isozymes of the alcohol dehydrogenase (ADH) system in the yeast Kluyveromyces lactis have been identified by hybridization to ADH2 DNA probes from Saccharomyces cerevisiae. In this paper we report on the isolation of KlADH4 and the complete sequencing of KlADH3 and KlADH4, two genes which show high homology to KlADH1, the ADH gene previously isolated in K. lactis, and to the ADH genes of S. cerevisiae. When compared with KlADH1, both KlADH3 and KlADH4 encode amino‐terminal extensions which show the characteristics of the mitochondrial targeting sequences. These extensions are poorly conserved both at the nucleotide and the amino acid level. Suprisingly, the KlADH4 extension shows a higher identity at the amino acid level to the one encoded by ADH3 of S. cerevisiae than to the KlADH3 presequence. KlADH3 and KlADH4, in contrast to the ADH3 gene of S. cerevisiae, show a strong bias in the choice of codons.

The nucleotide sequence of a 29·425 kb fragment localized on the left arm of chromosome XV from Saccharomyces cerevisiae has been determined. The sequence contains 13 open reading frames (ORFs) of which four encode the known genes ADH1, COQ3, MSH2 and RCF4. Predictions are made concerning the functions of the unknown ORFs. Some of the ORFs contain sequences similar to expressed sequences tags (EST) found in the database made available by TIGR. In particular, the highly expressed ADH1 gene is represented in this database by no less than 20 EST sequences. Two ARS sequences and a putative functional GCN4 motif have also been detected. One ORF (O0953) containing nine putative transmembrane segments is similar to a hypothetical membrane protein of Arabidopsis thaliana. Characteristic features of the other ORFs include ATP/GTP binding sites, a fungal Zn(2)‐Cys(6) binuclear centre, an endoplasmic reticulum targeting sequence, a β‐transducin repeat signature and in two instances, good similarity to the prokaryotic lipoprotein signal peptide motif. The sequence has been deposited in the EMBL data library under Accession Number X83121.

The nucleotide sequence of a fragment of 4867 base pairs of Saccharomyces cerevisiae chromosome II has been determined. The sequence contains three complete open reading frames. In addition to the already known gene RPB5, coding for a subunit shared by all three DNA directed RNA polymerases, two new open reading frames could be identified. YBR12.03 codes for a protein of 183 amino acids with homology to one of the proteins of the Bacillus subtilis riboflavin biosynthesis operon (RibG). Deletion mutants of YBR12.03 can germinate but stop growing after five to seven cell divisions on YPD. Supplementation with high concentrations of riboflavin does promote growth. YBR12.05 codes for a protein of 386 amino acids with homology to STI1, a stress‐inducible protein of S. cerevisiae. Deletion mutants of YBR12.05 are not viable.

We have studied the alcohol dehydrogenase (ADH) system in the yeast Kluyvefromyces lactis. Southern hybridization to the Saccharomyces cerevisiae ADH2 gene indicates four probable structural ADH genes in K. lactis. Two of these genes have been isolated from a genomic bank by hybridization to ADH2. The nucleotide sequence of one of these genes shows 80% and 50% sequence identity to the ADH genes of S. cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe respectively. One K. lactis ADH gene is preferentially expressed in glucose‐grown cells and, in analogy to S. cerevisiae, was named K1ADH1. The other gene, homologous to K1ADH1 in sequence, shows an amino‐terminal extension which displays all of the characteristics of a mitochondrial targeting presequence. We named this gene K1ADH3. The two genes have been localized on different chromosomes by Southern hybridization to an orthogonal‐field‐alternation gel electrophoresis‐resolved K. lactis genome. ADH activities resolved by gel electrophoresis revealed several ADH isozymes which are differently expressed in K. lactis cells depending on the carbon source.

Four genes coding for alcohol dehydrogenase (ADH) activities were identified in Kluyveromyces lactis. Due to the presence in this yeast of multiple ADH isozymes, mutants in the individual genes constructed by gene replacement yielded no clear phenotype. We crossed these mutants and developed a screening procedure which allowed us to identify strains lacking several ADH activities. The analysis of the adh triple mutants revealed that each activity confers to the cell the ability to grow on ethanol as the sole carbon source. On the contrary, adh null strains failed to grow on this substrate, indicating that no other important ADH activities are present in K. lactis cells. In the adh null mutants we also found a residual production of ethanol, as has been reported to be the case in Saccharomyces cerevisiae. This production showed a ten‐fold increase when the K1ADHI activity was reintroduced in the null mutant and cells were cultivated under oxygen‐limiting conditions. Differently from S. cerevisiae, glycerol is poorly accumulated in K. lactis adh null mutants.