Mô-đun dị loại mới cho sự huỷ bỏ gene cổ điển hoặc dựa trên PCR trong <i>Saccharomyces cerevisiae</i>

Yeast - Tập 10 Số 13 - Trang 1793-1808 - 1994
Achim Wach1, Arndt Brachat2, Rainer Pöhlmann2, Peter Philippsen2
1Institut für Angewandte Mikrobiologie, Universität Basel, Switzerland.
2Institut für Angewandte Mikrobiologie, Biozentrum, Universität Basel, Klingelbergstr. 70, CH‐4056 Basel, Switzerland

Tóm tắt

Tóm tắt

Chúng tôi đã xây dựng và kiểm nghiệm một mô-đun kháng sinh ưu thế, để lựa chọn các biến đổi gen của S. cerevisiae, hoàn toàn bao gồm DNA dị loại. Mô-đun kanMX này chứa khung đọc mở kanr đã biết của yếu tố di chuyển Tn903 từ E. coli kết hợp với các chuỗi điều khiển phiên mã và dịch mã của gene TEF từ nấm sợi Ashbya gossypii. Mô-đun lai này cho phép lựa chọn hiệu quả các biến đổi gen kháng lại geneticin (G418). Chúng tôi cũng đã xây dựng một mô-đun báo cáo lacZMT trong đó khung đọc mở của gene E. coli lacZ (thiếu 9 mã đầu tiên) được liên kết tại đầu 3′ với đoạn kết thúc S. cerevisiae ADH1. Mô-đun kanMX và mô-đun lacZMT, hoặc cả hai mô-đun cùng nhau, đã được nhân bản vào trung tâm của một chuỗi nhân bản đa dạng mới gồm 18 vị trí hạn chế duy nhất được bao bọc bởi các vị trí Not I. Sử dụng mô-đun kép cho việc xây dựng các sự thay thế trong khung của gene, chỉ cần một thí nghiệm biến đổi để kiểm nghiệm hoạt động của bộ khởi động và tìm kiếm các kiểu hình do việc bất hoạt gene này gây ra. Để cho phép việc sử dụng lặp lại sự lựa chọn G418, một số mô-đun kanMX được viền bằng các nhặp lại trực tiếp dài 470 bp, thúc đẩy việc loại ra in vivo với tần số từ 10–3 đến 10–4. Mô-đun kanMX dài 1,4 kb cũng đã được chứng minh là rất hữu ích cho các sự gián đoạn gene dựa trên PCR. Trong một thí nghiệm mà sự gián đoạn gene đã được thực hiện với các phân tử DNA mang theo các chuỗi kết thúc được thêm vào từ PCR chỉ có 35 baz đôi tương đồng với từng vị trí mục tiêu, tất cả mười hai thuộc địa kháng geneticin được kiểm tra đều mang mô-đun kanMX tích hợp đúng."

Từ khóa

#Mô-đun kháng dị loại #huỷ bỏ gene #<i>S. cerevisiae</i> #khung đọc mở #PCR #biến đổi gen #kháng geneticin #lựa chọn G418 #phiên mã #dịch mã #nấm sợi <i>Ashbya gossypii</i> #bất hoạt gene #lặp lại trực tiếp #tích hợp đúng #vị trí hạn chế #<i>in vivo</i>.

Tài liệu tham khảo

10.1126/science.2643162

10.1093/genetics/116.4.541

10.1002/yea.320101003

10.1016/0076-6879(83)01014-9

10.1093/nar/21.14.3329

10.1073/pnas.86.24.9976

10.1128/MCB.11.3.1295

10.1002/yea.320070506

10.1016/S0959-440X(94)90109-0

Boylan M., 1989, Fused bacterial luciferase subunits catalyze light emission in eukaryotes and prokaryotes, J. Biol. Chem., 264, 1915, 10.1016/S0021-9258(18)94118-9

Bullock W. O., 1987, XLI‐Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with β‐galactosidase selection, BioTechniques, 5, 376

10.1101/gad.8.9.1087

Casadaban M. J., 1980, In vitro fusions that join an enzymatically active β‐galactosidase segment to amino‐terminal fragments of exogenous proteins: Escherichia coli plasmid vectors for the detection and cloning of translational initiation signals, J. Bacteriol., 143, 971, 10.1128/jb.143.2.971-980.1980

10.1126/science.8303295

10.1073/pnas.88.21.9578

10.1002/yea.320100110

10.1016/0378-1119(88)90578-1

10.1002/yea.320101004

10.1038/369371a0

Feldmann H. Aigle M. Aljinovic G. André B. Baclet M. C. Barthe C. Baur A. Bécam A.‐M. Biteau N. Boles E.et al.(1994). Complete DNA sequence of yeast chromosome II.EMBO J.in press.

10.1038/369101a0

10.1016/0168-9525(93)90042-G

10.1073/pnas.78.4.2199

10.1007/BF00318211

10.1002/elps.1150071011

10.1128/jb.173.9.2993-2999.1991

Huisman O., 1987, A Tn10‐small lacZ‐kanR‐URA3 gene fusion transposon for insertion mutagenesis and fusion analysis of yeast and bacterial genes, Genetics, 116, 191, 10.1093/genetics/116.2.191

10.1016/0168-9525(90)90190-H

10.1128/MCB.11.6.3060

Ito H., 1983, Transformation of intact yeast cells treated with alkali ions, J. Bacteriol., 153, 163, 10.1128/jb.153.1.163-168.1983

10.1038/287869a0

10.1126/science.8091229

10.1016/0022-2836(81)90438-1

10.1038/357038a0

10.1073/pnas.78.10.6354

10.1002/yea.320010202

10.1002/j.1460-2075.1993.tb05956.x

10.1016/0378-1119(92)90691-H

10.1073/pnas.78.4.2460

10.1016/0076-6879(91)94022-5

10.1007/BF00312618

10.1093/genetics/122.1.19

10.1093/genetics/119.2.249

10.1007/BF00280415

10.1101/gad.2.5.517

Treco D. A., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, 13.1.1

10.1002/yea.320100202

10.1016/0378-1119(83)90194-4

10.1016/0378-1119(91)90593-Z

Thông tin
Thông tin xuất bản

Yeast

Tập 10 Số 13

1793-1808

Thông tin tác giả