Springer Science and Business Media LLC

Độ toàn vẹn của các phân tử RNA có tầm quan trọng hàng đầu trong các thí nghiệm cố gắng phản ánh bức tranh biểu hiện gen tại thời điểm chiết xuất RNA. Đến gần đây, chưa có tiêu chuẩn nào đáng tin cậy để ước lượng độ toàn vẹn của các mẫu RNA và tỷ lệ RNA ribosomal 28S:18S, thước đo phổ biến cho mục đích này, đã cho thấy sự không nhất quán. Sự xuất hiện của điện di vi mao cung cấp cơ sở cho một phương pháp tự động có độ thông lượng cao, nhằm ước lượng độ toàn vẹn của các mẫu RNA một cách dễ hiểu.

Các gen tham chiếu thường được sử dụng trong phân tích biểu hiện gen thường đã được chọn vì vai trò được biết đến hoặc nghi ngờ của chúng trong chức năng housekeeping, tuy nhiên sự biến động quan sát thấy ở hầu hết chúng cản trở việc sử dụng hiệu quả của chúng. Thiếu hụt các gen tham chiếu đã được xác thực chỉ rõ tầm quan trọng của một nghiên cứu hệ thống nhằm xác định chúng. Để chọn các ứng viên gen tham chiếu, chúng tôi đã phát triển một phương pháp in silico đơn giản dựa trên dữ liệu công khai có sẵn trong các cơ sở dữ liệu lúa mì Unigene và TIGR.

Sự ổn định biểu hiện của 32 gen đã được đánh giá bằng qRT-PCR sử dụng một bộ cDNA từ 24 mẫu thực vật khác nhau, bao gồm các mô, giai đoạn phát triển khác nhau và các điều kiện stress nhiệt. Các trình tự được chọn bao gồm 12 gen HKG nổi tiếng đại diện cho các lớp chức năng khác nhau và 20 gen mới có liên quan đến vấn đề chuẩn hóa. Sự ổn định biểu hiện của 32 gen ứng viên đã được thử nghiệm thông qua các chương trình máy tính geNorm và NormFinder sử dụng năm bộ dữ liệu khác nhau. Một số sự khác biệt đã được phát hiện trong việc xếp hạng các gen tham chiếu ứng viên, nhưng có sự đồng thuận đáng kể giữa các nhóm gen với biểu hiện ổn định nhất và ít ổn định nhất. Ba gen tham chiếu mới được xác định dường như hiệu quả hơn so với các gen housekeeping nổi tiếng và được sử dụng phổ biến để chuẩn hóa biểu hiện gen trong lúa mì. Cuối cùng, nghiên cứu biểu hiện của một gen mã hóa protein PDI-like cho thấy rằng việc đánh giá chính xác của nó phụ thuộc vào việc áp dụng các gen chuẩn hóa phù hợp và có thể bị ảnh hưởng tiêu cực bởi việc sử dụng các gen HKG truyền thống với biểu hiện không ổn định, chẳng hạn như actin và α-tubulin.

Nghiên cứu hiện tại đại diện cho lần sàng lọc rộng đầu tiên nhằm xác định các gen tham chiếu và các cặp mồi tương ứng được thiết kế đặc biệt cho các nghiên cứu biểu hiện gen trong lúa mì, đặc biệt là cho các phân tích qRT-PCR. Nhiều gen tham chiếu mới được xác định vượt trội hơn các gen HKG truyền thống về mặt ổn định biểu hiện trong tất cả các điều kiện đã thử nghiệm. Các gen tham chiếu mới sẽ cho phép chuẩn hóa và định lượng chính xác hơn về biểu hiện gen trong lúa mì và sẽ hữu ích cho việc thiết kế các cặp mồi nhắm vào các gen cùng nguồn gốc ở các loài thực vật khác.

RT-qPCR là phương pháp được ưu tiên để định lượng nhanh chóng và đáng tin cậy trong các nghiên cứu về biểu hiện gen. Việc áp dụng thích hợp RT-qPCR trong các nghiên cứu như vậy yêu cầu sử dụng các gen tham chiếu như một chất đối chứng nội bộ để chuẩn hóa nồng độ mRNA giữa các mẫu khác nhau nhằm so sánh chính xác mức độ biểu hiện gen. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng không có gen tham chiếu đơn nhất nào được công nhận cho tất cả các thí nghiệm. Do đó, việc xác định các gen tham chiếu chất lượng cao là rất quan trọng cho việc phân tích dữ liệu từ RT-qPCR. Chỉ có một vài nghiên cứu về các gen tham chiếu đã được thực hiện trên thực vật và không có nghiên cứu nào trên cây đào (Prunus persica L. Batsch). Vì vậy, nghiên cứu hiện tại được tiến hành để xác định các gen tham chiếu phù hợp cho việc chuẩn hóa biểu hiện gen ở cây đào.

Trong nghiên cứu này, mười một gen tham chiếu đã được kiểm tra trên các mẫu đào khác nhau sử dụng RT-qPCR với SYBR green. Các gen này bao gồm: actin 2/7 (ACT), cyclophilin (CYP2), RNA polymerase II (RP II), phospholipase A2 (PLA2), protein ribosome L13 (RPL13), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), RNA ribosome 18S (18S rRNA), tubblin beta (TUB), tubblin alpha (TUA), yếu tố kéo dài dịch mã 2 (TEF2) và ubiquitin 10 (UBQ10). Tất cả mười một gen tham chiếu đều có giá trị C_q rất đa dạng trong tất cả các mẫu, cho thấy rằng chúng được biểu hiện khác nhau. Độ ổn định của các gen này, ngoại trừ RPL13, đã được xác định bằng ba thống kê mô tả khác nhau, geNorm, NormFinder và BestKeeper, cho ra các kết quả có sự so sánh cao.

RT-PCR thời gian thực là phương pháp được khuyến nghị cho phân tích biểu hiện gen định lượng. Một bước bắt buộc là chọn các gen tham chiếu tốt để chuẩn hóa. Một vài gen thường được gọi là gen HouseKeeping (HSK), chẳng hạn như ACT1, RDN18 hoặc PDA1, là một trong những gen được sử dụng phổ biến nhất, vì có giả định rằng biểu hiện của chúng không thay đổi nhiều trong một loạt các điều kiện. Vì giả định này rất khó xảy ra, việc trung bình hình học của nhiều gen kiểm soát nội bộ được chọn cẩn thận hiện được khuyến nghị mạnh mẽ cho việc chuẩn hóa nhằm tránh vấn đề biến thiên biểu hiện của các gen tham chiếu đơn lẻ. Mục tiêu của công việc này là tìm kiếm một tập hợp các gen tham chiếu cho phân tích biểu hiện gen chính xác trong Saccharomyces cerevisiae.

Từ các tập dữ liệu vi điều hòa công khai, chúng tôi đã chọn các gen tham chiếu tiềm năng mà biểu hiện của chúng rõ ràng vẫn không thay đổi trong quá trình phát triển lâu dài trên glucose. Sử dụng thuật toán geNorm, ALG9, TAF10, TFC1 và UBC6 đã cho thấy là những gen có biểu hiện ổn định, không phụ thuộc vào các điều kiện phát triển và nền tảng chủng đã thử nghiệm trong nghiên cứu này. Chúng tôi sau đó đã chỉ ra rằng trung bình hình học của bất kỳ tập hợp nào gồm ba gen trong số sáu gen ổn định nhất cũng cho kết quả dữ liệu chuẩn hóa rất tương đồng, điều này khác biệt với các kết quả không nhất quán giữa các mẫu sinh học khác nhau khi chuẩn hóa được thực hiện với ACT1. Do đó, việc chuẩn hóa với nhiều gen được chọn đã được áp dụng cho phân tích phiên mã của các gen liên quan đến chuyển hóa glycogen. Chúng tôi đã xác định tỷ lệ cảm ứng là 100 lần cho GPH1 và 20 lần cho GSY2 giữa pha số mũ và chuyển tiếp diauxic trên glucose. Không có sự cảm ứng của hai gen này ở pha chuyển tiếp trên galactose, mặc dù trong cả hai trường hợp, động học tích lũy glycogen là tương tự nhau. Ngược lại, biểu hiện của SGA1 không phụ thuộc vào nguồn carbon và tăng gấp 3 lần ở pha dừng lại.

Trong công việc này, chúng tôi đã cung cấp một tập hợp các gen phù hợp làm gen tham chiếu cho phân tích biểu hiện gen định lượng bằng RT-PCR thời gian thực trên các mẫu sinh học men bao gồm một bảng lớn các trạng thái sinh lý. Ngược lại, chúng tôi đã không xác nhận và không khuyến khích việc sử dụng ACT1 cũng như các gen tham chiếu thường sử dụng khác (PDA1, TDH3, RDN18, v.v.) làm các kiểm soát nội bộ cho phân tích biểu hiện gen định lượng trong men.

Quantitative real-time reverse transcriptase PCR (RT-qPCR) has been widely used for quantification of mRNA as a way to determine key genes involved in different biological processes. For accurate gene quantification analysis, normalization of RT-qPCR data is absolutely essential. To date, normalization is most frequently achieved by the use of internal controls, often referred to as reference genes. However, several studies have shown that the reference genes used for the quantification of mRNA expression can be affected by the experimental set-up or cell type resulting in variation of the expression level of these key genes. Therefore, the evaluation of reference genes is critical for gene expression profiling, which is often neglected in gene expression studies of insects. For this purpose, ten candidate reference genes were investigated in three different tissues (midgut, Malpighian tubules, and fat body) of the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel).

Two different programs, geNorm and Normfinder, were used to analyze the data. According to geNorm, α-TUB + ACT5 are the most appropriate reference genes for gene expression profiling across the three different tissues in the female flies, while ACT3 + α-TUB are considered as the best for males. Furthermore, we evaluated the stability of the candidate reference genes to determine the sexual differences in the same tissue. In the midgut and Malpighian tubules, ACT2 + α-TUB are the best choice for both males and females. However, α-TUB + ACT1 are the best pair for fat body. Meanwhile, the results calculated by Normfinder are quite the same as the results with geNorm; α-TUB is always one of the most stable genes in each sample validated by the two programs.

In this study, we validated the suitable reference genes for gene expression profiling in different tissues of B. dorsalis. Moreover, appropriate reference genes were selected out for gene expression profiling of the same tissues taking the sexual differences into consideration. This work not only formed a solid basis for future gene expression study in B. dorsalis, but also will serve as a resource to screen reference genes for gene expression studies in any other insects.